Desempenho de quatro ensaios de amplificação de ácidos nucleicos para identificar SARS-CoV-2 na Etiópia

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Desde o surto da doença coronavírus (COVID-19) de 2019, muitos testes comerciais de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs) foram desenvolvidos em todo o mundo e tornaram-se ensaios padrão. Embora vários testes tenham sido rapidamente desenvolvidos e aplicados a testes de diagnóstico laboratorial, o desempenho desses testes não foi avaliado em vários ambientes. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho dos ensaios Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech utilizando o Composite Reference Standard (CRS). O estudo foi realizado no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) de 1 a 30 de dezembro de 2020. 164 amostras nasofaríngeas foram extraídas usando o mini kit QIAamp RNA e o sistema de preparação de amostras de DNA Abbott. Das 164 amostras, 59,1% foram positivas e 40,9% foram negativas para SRC. A positividade da Sansure Biotech foi significativamente baixa em comparação com a CRS (p < 0,05). A positividade da Sansure Biotech foi significativamente baixa em comparação com a CRS (p < 0,05). Os resultados positivos da Sansure Biotech foram avaliados com base no CRS (p < 0,05). Os resultados positivos da Sansure Biotech foram significativamente menores em comparação com o CRS (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 A Sansure Biotech obteve resultados positivos com CRS (p < 0,05). A Sansure Biotech teve significativamente menos resultados positivos em comparação com a CRS (p < 0,05).A concordância geral das quatro análises foi de 96,3–100% em comparação com a CRS. Além da baixa taxa de positividade do ensaio Sansure Biotech, o desempenho dos quatro ensaios foi quase comparável. Como tal, o ensaio Sansure Biotech [Research Only (RUO)] requer validação adicional para a sua utilização na Etiópia. Finalmente, pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar ensaios com afirmações apropriadas do fabricante.
Os testes laboratoriais fazem parte do Plano Estratégico para a Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19) da Organização Mundial da Saúde (OMS) (SPRP). A OMS aconselha que os países precisam de desenvolver capacidade laboratorial para melhorar a preparação, a gestão adequada dos casos, a vigilância e a resposta rápida aos desafios de saúde pública. Isto sugere que o papel do laboratório é fundamental para caracterizar a doença e a epidemiologia dos agentes infecciosos emergentes e controlar a sua propagação.
O diagnóstico da COVID-19 requer informações epidemiológicas e médicas, sintomas/sinais pessoais e dados radiográficos e laboratoriais2. Desde que o surto de COVID-19 foi relatado em Wuhan, China, muitos testes comerciais de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs) foram desenvolvidos em todo o mundo. A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (rRT-PCR) tem sido usada como método rotineiro e padrão para diagnóstico laboratorial da infecção por síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2)3. A detecção molecular de SARS-CoV-2 é normalmente baseada nos genes N (gene da proteína do nucleocapsídeo), E (gene da proteína do envelope) e RdRp (gene da RNA polimerase dependente de RNA) em ORF1a/b (quadro de leitura aberto 1a/b) . gene) região identificada a partir do genoma viral. São consideradas as principais regiões conservadas encontradas nos genomas virais para reconhecimento de vírus4. Dentre esses genes, os genes RdRp e E apresentam alta sensibilidade de detecção analítica, enquanto o gene N apresenta baixa sensibilidade analítica5.
O desempenho dos ensaios de PCR pode variar dependendo de vários fatores, tais como: reagentes de extração, reagentes de amplificação/detecção, método de extração, qualidade da máquina de PCR e outros instrumentos. Em abril de 2020, mais de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países receberam Autorização de Uso de Emergência (EUA) para diagnóstico da COVID-196. Na Etiópia, mais de 14 plataformas de PCR em tempo real são utilizadas para detecção por PCR do SARS-CoV-2 em 26 instituições de saúde pública, incluindo ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7. Além disso, vários kits de teste PCR estão disponíveis, como o teste Daan Gene, o teste Abbott SARS-CoV-2, o teste Sansure Biotech e o teste SARS-CoV-2 BGI. Embora o rRT-PCR seja altamente sensível, alguns pacientes com COVID-19 relatam resultados falsos negativos devido a cópias insuficientes de ácido ribonucleico viral (RNA) em amostras devido à coleta, transporte, armazenamento e manuseio inadequados e testes laboratoriais. condições e ações do pessoal8. Além disso, o manuseamento incorreto da amostra ou do controlo, a definição do limiar do ciclo (Ct) e a reatividade cruzada com outros ácidos nucleicos patogénicos ou ARN SARS-CoV-2 inativo/residual podem levar a resultados falsos positivos em ensaios rRT-PCR9. Assim, fica claro que os testes de PCR podem de fato identificar portadores de fragmentos de genes, pois não conseguem sequer distinguir entre genes virais verdadeiramente ativos, de modo que os testes só conseguem identificar portadores e não pacientes10. Portanto, é importante avaliar o desempenho diagnóstico usando métodos padrão em nosso meio. Embora muitos reagentes NAAT estejam disponíveis no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) e em todo o país, ainda não foi relatada nenhuma avaliação comparativa da sua eficácia. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho comparativo de kits comercialmente disponíveis para detecção de SARS-CoV-2 por rRT-PCR utilizando amostras clínicas.
Um total de 164 participantes com suspeita de COVID-19 foram incluídos neste estudo. A maioria das amostras era de centros de tratamento (118/164 = 72%), enquanto os restantes 46 (28%) participantes eram de centros sem tratamento. Entre os participantes não atendidos no centro, 15 (9,1%) tinham casos clinicamente suspeitos e 31 (18,9%) tinham contatos de casos confirmados. Noventa e três (56,7%) participantes eram do sexo masculino e a idade média (± DP) dos participantes foi de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo foram determinadas taxas positivas e negativas de quatro testes para COVID-19. Assim, as taxas positivas do ensaio Abbott SARS-CoV-2, do ensaio Daan Gene 2019-nCoV, do ensaio SARS-CoV-2 BGI e do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foram de 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%, respectivamente. . As pontuações positivas e negativas do padrão de referência composto (CRS) foram 97 (59,1%) e 67 (40,9%), respectivamente (Tabela 1). Neste estudo, a definição de RSC baseou-se na regra “qualquer positivo”, segundo a qual de quatro resultados de testes, dois ou mais resultados de testes que deram o mesmo resultado foram considerados verdadeiros positivos ou negativos.
Neste estudo, encontramos uma concordância percentual negativa (NPA) de 100% (IC 95% 94,6–100) para todas as análises em comparação com o CRS. A análise da Sansure Biotechnology mostrou um PPA mínimo de 93,8% (IC 95% 87,2-97,1) e a análise Daan Gene 2019-nCoV teve uma concordância geral de 99,4% (IC 95% 96,6-99,9). Em contraste, a concordância geral entre o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foi de 98,8% e 96,3%, respectivamente (Tabela 2).
O coeficiente de concordância kappa de Cohen entre os resultados do ensaio CRS e Abbott SARS-CoV-2 foi totalmente consistente (K = 1,00). Da mesma forma, os valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV também são totalmente consistentes com SRC (K ≥ 0,925). Nesta análise comparativa, o teste qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que os resultados do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foram significativamente diferentes dos resultados do CRS (p = 0,031) (Tabela 2).
Como mostrado na Fig.1, a porcentagem do valor Ct mais baixo (<20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinados) foi de 87,6% e o valor Ct do gene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem de baixo O valor Ct (<20 Ct) foi de 50,3% e o valor Ct alto (36–40 Ct) foi 3,2%. 1, a porcentagem do valor Ct mais baixo (<20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinados) foi de 87,6% e o valor Ct do gene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem de baixo O valor Ct (<20 Ct) foi de 50,3% e o valor Ct alto (36–40 Ct) foi 3,2%.Como mostrado na Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) analisado Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp e N) obteve 87,6%, e Análise de Ct por ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV fornece um valor de Ct (< 20 Ct) de 50,3%, высокое значение Ct (36–40 Ct) custa 3,2%. 1, a porcentagem do valor Ct mais baixo (<20 Ct) da análise do Abbott SARS-CoV-2 (gene combinado RdRp e N) foi de 87,6%, e o valor Ct da análise do gene ORF1a/b da Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem de baixo valor Ct (<20 Ct) representou 50,3%, e alto valor Ct (36–40 Ct) representou 3,2%.如图1 所示, Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%,高Ct 值(36–40 Ct) A taxa de crescimento é de 3,2%。 Conforme mostrado na Figura 1, a porcentagem mais baixa do valor Ct (<20 Ct) do teste Abbott SARS-CoV-2 (combinação do gene RdRp e N) é de 87,6%, o valor Ct do gene ORF1a/b do teste Sansure Biotech 2019-nCoV mostra baixo Ct值(<20 Ct) 的 a porcentagem é 50,3%, 高Ct A porcentagem de (36–40 Ct) é de 3,2%. No caso do risco 1, analisamos o Abbott SARS-CoV-2 (com os genes RdRp e N) e o número de telefone celular Ct (< 20 Ct) em uma proporção de 87,6%, e Ct гена ORF1a/b aprovado pela Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Conforme mostrado na Figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (combinando os genes RdRp e N) teve o menor valor percentual de Ct (<20 Ct) em 87,6%, enquanto o valor de Ct do gene ORF1a/b no Sansure Estudo Biotech 2019 – A análise do nCoV mostrou um Ct baixo. O valor percentual (< 20 Ct) custa 50,3%, e o valor percentual percentual (36–40 Ct) equivale a 3,2%. A percentagem de valores (<20 Ct) foi de 50,3%, e a percentagem de valores elevados de Ct (36–40 Ct) foi de 3,2%.O teste Abbott SARS-CoV-2 B registrou valores de Ct acima de 30. Por outro lado, no ensaio BGI SARS-CoV-2 o gene ORF1a/b apresentou um valor Ct elevado (> 36 Ct), a percentagem foi de 4% (Fig. 1). Por outro lado, no ensaio BGI SARS-CoV-2 o gene ORF1a/b apresentou um valor Ct elevado (> 36 Ct), a percentagem foi de 4% (Fig. 1). Para os medicamentos, na análise do BGI SARS-CoV-2, o ORF1a/b tem um valor de Ct (> 36 Ct), uma proporção maior que 4% (рис. 1). Por outro lado, na análise do BGI o gene SARS-CoV-2 ORF1a/b apresentou um valor de Ct elevado (> 36 Ct), cujo percentual foi de 4% (fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Por outro lado, na detecção BGI SARS-CoV-2, a porcentagem do gene ORF1a/b com alto valor de Ct (>36 Ct) é de 4% (Figura 1). Em comparação com outras drogas, na análise do BGI SARS-CoV-2, o gene ORF1a/b é medido em Ct (>36 Ct) 4% (riso 1). Por outro lado, na análise BGI SARS-CoV-2, a percentagem de genes ORF1a/b com valores elevados de Ct (>36 Ct) foi de 4% (Fig. 1).
Neste estudo, coletamos 164 amostras nasofaríngeas. Para todos os tipos de ensaios, o isolamento e amplificação do RNA foram realizados utilizando os métodos e kits recomendados pelos respectivos fabricantes.
Este estudo demonstrou que o teste da Abbott para SARS-CoV-2 tem o mesmo desempenho de detecção que o CRS, com 100% de concordância positiva, negativa e geral. A concordância kappa de Cohen é 1,00, indicando concordância total com o CRS. Um estudo semelhante realizado pela Universidade de Washington, nos EUA, descobriu que a sensibilidade e a especificidade gerais do teste Abbott para SARS-CoV-2 foram de 93% e 100%, respectivamente, em comparação com o ensaio determinado em laboratório (LDA) do CDC. . 11. O sistema de detecção Abbott SARS-CoV-2 baseia-se na detecção combinada simultânea dos genes N e RdRp, pois ambos os genes são mais sensíveis, minimizando falsos negativos12. Um estudo realizado em Viena, Áustria, também mostrou que grandes volumes de amostras de extração e volumes de eluentes de detecção minimizaram os efeitos de diluição e aumentaram a eficiência de detecção13. Assim, a combinação perfeita da Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pode ser associada a um sistema de detecção de plataforma que detecta simultaneamente genes combinatórios, extrai um grande número de amostras (0,5 ml) e utiliza uma grande quantidade de eluente (40 µl).
Nossos resultados também mostraram que o desempenho de detecção do teste genético Daan foi quase igual ao do CRS. Isto é consistente com um estudo14 realizado na Universidade de Anhui em Huainan, China, e com a afirmação do fabricante de uma concordância 100% positiva. Apesar dos relatos de resultados consistentes, uma amostra apresentou resultado falso negativo após novo teste do mesmo eluato, mas foi positiva nos ensaios Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019. Isto sugere que pode haver variabilidade nos resultados entre diferentes tipos de ensaios. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação com o ensaio de referência definido pelo laboratório. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação com o ensaio de referência definido pelo laboratório. Isso não é verdade, no teste, provado na Kita15, resultado da análise de Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от é uma análise detalhada do laboratório. Entretanto, em um estudo na China15, o resultado da análise de Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) da análise de referência do laboratório.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p <0,05）。然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, provado em Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) para testar seu teste de laboratório. Entretanto, em estudo realizado na China15, os resultados do teste genético de Daan foram significativamente diferentes (p < 0,05) em comparação ao seu teste laboratorial de referência.Esta discrepância pode ser devida à sensibilidade do teste de referência para detectar SARS-CoV-2, e estudos adicionais podem ser importantes para determinar a causa.
Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho comparativo do ensaio SARS-CoV-2 BGI com CRS, mostrando excelente concordância percentual positiva (PPA = 97,9%), concordância percentual negativa (NPA = 100%) e concordância percentual geral por gênero ( OPA). ). = 98,8%). Os valores Kappa de Cohen apresentaram boa concordância (K = 0,975). Estudos na Holanda16 e na China15 mostraram resultados consistentes. O teste SARS-CoV-2 BGI é um teste de detecção de gene único (ORF1a/b) que utiliza 10 µl de eluato de amplificação/detecção. Apesar da boa concordância estatística com os nossos resultados de referência, a análise perdeu duas amostras positivas (1,22%) da amostra total. Isto pode ter enormes implicações clínicas para a dinâmica de transmissão, tanto a nível do paciente como da comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensaio Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); a porcentagem geral de correspondência foi de 96,3%. A força de concordância também foi determinada pelo valor Kappa de Cohen, que foi de 0,925, indicando plena concordância com o CRS. Novamente, nossos resultados são idênticos aos estudos realizados na Universidade Central Sul em Changsha, China, e no Departamento de Laboratório Clínico do Hospital Popular de Liuzhou, cidade de Liuzhou, China17. Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste qui-quadrado (teste MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao CRS (p < 0,005). Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste qui-quadrado (teste MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao CRS (p < 0,005). Não é isso que é uma questão de segurança para você, critérios хи-квадрат (критерий Макнемара) é um recurso que permite analisar a Sansure Biotech com uma estatística estatística de uso сравнению с CRS (p < 0,005). Embora tenha sido registrada a boa concordância estatística acima, o teste qui-quadrado (teste McNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech apresentou diferença estatisticamente significativa em relação ao CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性, 但卡方检验（MacNemar 检验）表明, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 , 但 检验 （(macnemar 检验 表明 , , sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） A maneira mais fácil de usar suas estatísticas é o que significa que você precisa de um critério de criptografia (critério Macnemaра) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech e CRS. Apesar da boa concordância estatística observada acima, o teste qui-quadrado (teste McNemar) mostrou diferença estatisticamente significativa (p < 0,005) entre o ensaio Sansure Biotech e o CRS.Seis amostras (3,66%) foram consideradas falso-negativas em comparação com CRS (Tabela Suplementar 1); isto é muito importante, especialmente dada a dinâmica de transmissão do vírus. Os dados acima também apoiam esta baixa taxa de detecção15.
Neste estudo, foram determinados valores de Ct para cada ensaio e respetiva plataforma, sendo o valor médio de Ct mais baixo reportado no ensaio Abbott SARS-CoV-2. Este resultado pode estar relacionado ao sistema de testes genéticos combinados simultâneos da Abbott para detecção de SARS-CoV-2. Portanto, de acordo com a Figura 1, 87,6% dos resultados do Abbott SARS-CoV-2 apresentaram valores de Ct abaixo de 20. Apenas um pequeno número de resultados de amostras (12,4%) estavam na faixa de 20-30. Valores de Ct acima de 30 não foram registrados. Além do uso do formato de teste genético de painel SARS-CoV-2 pela Abbott, esse resultado pode estar relacionado ao limite inferior de detecção (32,5 cópias de RNA/mL)18, que é três vezes inferior ao limite inferior da empresa de 100 cópias de RNA /mL. ml)19.
Este estudo tem algumas limitações: em primeiro lugar, não temos métodos padrão/de referência [como carga viral ou outros testes laboratoriais (LDA)] devido à falta de recursos. Em segundo lugar, todas as amostras utilizadas neste estudo foram esfregaços nasofaríngeos, enquanto os resultados não foram aplicáveis ​​a outros tipos de amostras e, em terceiro lugar, o tamanho da nossa amostra foi pequeno.
Este estudo comparou o desempenho de quatro ensaios rRT-PCR para SARS-CoV-2 utilizando amostras nasofaríngeas. Todos os ensaios de detecção tiveram desempenho quase comparável, com exceção do ensaio Sansure Biotech. Além disso, foi identificada baixa taxa de positividade no ensaio Sansure Biotech em comparação ao CRS (p < 0,05). Além disso, foi identificada baixa taxa de positividade no ensaio Sansure Biotech em comparação ao CRS (p < 0,05). Além disso, no teste Sansure Biotech, você pode obter resultados positivos com CRS (p < 0,05). Além disso, o teste Sansure Biotech apresentou baixo percentual de resultados positivos em comparação ao CRS (p < 0,05).此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Além disso, a Sansure Biotech analisou os resultados mais positivos do CRS (p < 0,05). Além disso, o ensaio Sansure Biotech apresentou uma taxa de positividade menor em comparação ao CRS (p < 0,05).A análise da Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA e concordância geral excedeu 93,5% com um valor de força de concordância Cohen Kappa de 0,925. Finalmente, o Sansure Biotech Assay (RUO) necessita de validação adicional para utilização na Etiópia, e investigação adicional deve ser considerada para avaliar as alegações de fabricantes individuais.
O desenho do estudo comparativo foi realizado em quatro unidades de saúde em Adis Abeba, no Hospital Eka Kotebe, no Centro de Tratamento da Igreja Millennium, no Hospital Memorial Zewooditu e no Hospital Especializado em Tuberculose de São Pedro. Os dados foram coletados entre 1º e 31 de dezembro de 2020. As instalações médicas para este estudo foram escolhidas propositalmente com base no elevado número de casos e na disponibilidade dos principais centros de tratamento na cidade. Da mesma forma, os instrumentos, incluindo os instrumentos de PCR em tempo real ABI 7500 e Abbott m2000, foram selecionados de acordo com as recomendações dos fabricantes de reagentes NAAT, e quatro kits de detecção de PCR foram selecionados para este estudo, já que a maioria dos laboratórios na Etiópia utilizou pelo menos pelo menos quatro deles. Teste genético, teste Abbott SARS-CoV-2, teste Sansure Biotech e teste SARS-CoV-2 BGI realizados durante o estudo).
A testagem para SARS-CoV-2 foi realizada de 1º a 30 de dezembro de 2020 utilizando 3 ml de Meio de Transporte Viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de indivíduos sob investigação para COVID-19 encaminhados ao EPHI. Amostras nasofaríngeas foram coletadas por coletores de amostras treinados e enviadas ao EPHI em embalagens triplas. Antes do isolamento do ácido nucleico, a cada amostra é atribuído um número de identificação único. A extração é realizada de cada amostra imediatamente após a chegada, usando métodos de extração manuais e automáticos. Assim, para a extração automática do Abbott m2000, 1,3 ml (incluindo 0,8 ml de volume morto e 0,5 ml de volume de entrada de extração) da amostra foram extraídos de cada amostra e passados ​​através do Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA). ) Um lote de 96 [92 amostras, dois controles de detecção e dois controles sem modelo (NTC)] foi incluído no processo geral (recuperação e detecção) de duas rodadas de SARS-CoV-2 (EUA) em tempo real. mineração. Da mesma forma, para extração manual, use as mesmas amostras (para extração e descoberta automática). Assim, ao longo do processo, amostras de 140 µl foram aliquotadas e extraídas usando o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) em lotes de 24 (incluindo 20 amostras, dois controles de ensaio e dois NTCs) ao longo de nove rodadas. Os eluatos extraídos manualmente foram amplificados e detectados usando um termociclador ABI 7500 usando o ensaio SARS-CoV-2 BGI, o ensaio Daan Gene e o ensaio Sansure Biotech.
O isolamento e a purificação automatizados do RNA viral do SARS-CoV-2 seguem o princípio do grânulo magnético usando reagentes de preparação de amostras de DNA da Abbott. A inativação das amostras e a solubilização das partículas virais é realizada utilizando um detergente contendo isotiocianato de guanidina para desnaturar a proteína e inativar a RNase. O RNA é então separado da proteína por separação em fase sólida usando sílica, ou seja, o sal de guanidínio e o pH alcalino do tampão de lise promovem a ligação dos ácidos nucleicos à sílica (SiO2). A etapa de enxágue remove proteínas e detritos restantes para produzir uma solução transparente. O RNA transparente é isolado de micropartículas à base de sílica utilizando o campo magnético do instrumento20,21. Por outro lado, o isolamento e purificação manual do RNA é realizado pelo método de coluna giratória utilizando centrifugação em vez de suporte magnético e separação das micropartículas do eluente.
O teste Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, que recebeu EUA19,22 da OMS e FDA. Neste protocolo, a inativação da amostra antes da extração foi realizada em banho-maria a 56 °C por 30 min. Após a inativação do vírus, a extração de ácido nucleico foi realizada em um instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM usando um sistema de preparação de amostras de DNA Abbott m2000. de acordo com o fabricante. A amplificação e a detecção foram realizadas utilizando um instrumento Abbott m2000 RT-PCR, e a detecção dupla foi realizada para os genes RdRp e N. ROX) e VIC P (corante proprietário) para direcionamento e detecção de controles internos, permitindo a detecção simultânea de ambos os produtos de amplificação 19 .
O método de detecção de amplificação deste kit é baseado na tecnologia RT-PCR de uma etapa. Os genes ORF1a/b e N foram selecionados como regiões conservadas pela Daan Gene Technology para detectar a amplificação da região alvo. Primers específicos e sondas fluorescentes (sondas do gene N marcadas com FAM, sondas ORF1a/b marcadas com VIC) foram projetadas para detectar RNA de SARS-CoV-2 em amostras. O eluente final e as misturas principais foram preparados adicionando 5 µl de eluente a 20 µl da mistura principal até um volume final de 25 µl. A amplificação e a detecção foram realizadas simultaneamente em um instrumento de PCR em tempo real ABI 750024.
Os genes ORF1a/b e N foram detectados usando o Kit de Diagnóstico de Ácido Nucleico Sansure Biotech nCoV-2019 (detecção de PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada gene alvo selecionando o canal FAM para a região ORF1a/b e o canal ROX para o gene N. A este kit de ensaio, são adicionados o eluente e os reagentes da mistura principal da seguinte forma: preparar 30 µl de reagente da mistura principal e 20 µl de amostra eluída para detecção/amplificação. PCR em tempo real ABI 750025 foi utilizado para amplificação/detecção.
O teste SARS-CoV-2 BGI é um kit fluorescente de rRT-PCR em tempo real para o diagnóstico de COVID-19. A região alvo está localizada na região ORF1a/b do genoma do SARS-CoV-2, que é um método de detecção de gene único. Além disso, o gene doméstico humano β-actina é um gene alvo regulado internamente. O master mix é preparado misturando 20 µl do reagente master mix e 10 µl da amostra de RNA extraída em uma placa de poço26. Um instrumento de PCR quantitativo em tempo real fluorescente ABI 7500 foi utilizado para amplificação e detecção. Todas as amplificações de ácidos nucleicos, condições de execução de PCR para cada ensaio e interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com as instruções do respectivo fabricante (Tabela 3).
Nesta análise comparativa, não utilizamos o método padrão de referência para determinar a concordância percentual (positiva, negativa e geral) e outros parâmetros de comparação para as quatro análises. Cada comparação de teste foi feita com CRS, neste estudo o CRS foi definido pela regra “qualquer positivo” e o resultado foi determinado, não por um único teste, utilizamos pelo menos dois resultados de testes correspondentes. Além disso, no caso da transmissão da COVID-19, os resultados falsos negativos são mais perigosos do que os resultados falsos positivos. Portanto, para dizer “positivo” com a maior precisão possível a partir de um resultado CRS, pelo menos dois testes de ensaio devem ser positivos, o que significa que é provável que pelo menos um resultado positivo venha de um ensaio EUA. Assim, de quatro resultados de testes, dois ou mais resultados de testes que dão o mesmo resultado são considerados verdadeiros positivos ou negativos18,27.
Os dados foram coletados por meio de formulários estruturados de extração de dados, a entrada e análise dos dados foram realizadas no software estatístico Excel e SPSS versão 23.0 para estatística descritiva. Foram analisados ​​os percentuais de concordância positiva, negativa e geral, e um escore Kappa foi utilizado para determinar o grau de concordância de cada método com o CRS. Os valores de Kappa são interpretados da seguinte forma: 0,01 a 0,20 para concordância leve, 0,21 a 0,40 para concordância geral, 0,41-0,60 para concordância moderada, 0,61-0,80 para concordância maior e 0,81-0,99 para concordância completa28.
A autorização ética foi obtida da Universidade de Adis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foram aprovados pelo Conselho de Revisão de Ética Científica do Instituto de Saúde Pública da Etiópia. O número de referência para a Licença de Ética EPHI é EPHI/IRB-279-2020. Todos os métodos foram aplicados de acordo com as recomendações e disposições das Diretrizes Nacionais Abrangentes da Etiópia para o Tratamento da COVID-19. Além disso, o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo antes da participação no estudo.
Todos os dados obtidos ou analisados ​​neste estudo estão incluídos neste artigo publicado. Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis no respectivo autor mediante solicitação razoável.
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