Desempenho de quatro ensaios de amplificação de ácidos nucleicos para identificar SARS-CoV-2 na Etiópia

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Desde o surto da doença do coronavírus de 2019 (COVID-19), muitos testes comerciais de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs) foram desenvolvidos em todo o mundo e se tornaram ensaios padrão. Embora vários testes tenham sido rapidamente desenvolvidos e aplicados a testes de diagnóstico laboratorial, o desempenho desses testes não foi avaliado em uma variedade de cenários. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho dos ensaios Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech usando o Padrão de Referência Composto (CRS). O estudo foi conduzido no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) de 1 a 30 de dezembro de 2020. 164 amostras nasofaríngeas foram extraídas usando o mini kit QIAamp RNA e o sistema de preparação de amostras de DNA Abbott. De 164 espécimes, 59,1% foram positivos e 40,9% foram negativos para CRS. A positividade da Sansure Biotech foi significativamente baixa em comparação com a CRS (p < 0,05). A positividade da Sansure Biotech foi significativamente baixa em comparação com a CRS (p < 0,05). Os resultados positivos da Sansure Biotech foram avaliados com base no CRS (p < 0,05). Os resultados positivos da Sansure Biotech foram significativamente menores em comparação ao CRS (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 A Sansure Biotech obteve resultados positivos com CRS (p < 0,05). A Sansure Biotech teve significativamente menos resultados positivos em comparação ao CRS (p < 0,05).A concordância geral das quatro análises foi de 96,3% a 100% em comparação com a CRS. Além da baixa taxa de positividade do ensaio da Sansure Biotech, o desempenho dos quatro ensaios foi quase comparável. Portanto, o ensaio da Sansure Biotech [Somente Pesquisa (RUO)] requer validação adicional para seu uso na Etiópia. Por fim, pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar ensaios com as alegações apropriadas do fabricante.
Os testes laboratoriais fazem parte do Plano Estratégico de Preparação e Resposta à Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19) da Organização Mundial da Saúde (OMS). A OMS recomenda que os países desenvolvam capacidade laboratorial para melhorar a preparação, o gerenciamento adequado de casos, a vigilância e a resposta rápida aos desafios de saúde pública. Isso sugere que o papel do laboratório é fundamental para caracterizar a doença e a epidemiologia de agentes infecciosos emergentes e controlar sua disseminação.
O diagnóstico da COVID-19 requer informações epidemiológicas e médicas, sintomas/sinais pessoais e dados radiográficos e laboratoriais2. Desde que o surto de COVID-19 foi relatado em Wuhan, China, muitos testes comerciais de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs) foram desenvolvidos em todo o mundo. A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (rRT-PCR) tem sido usada como um método de rotina e padrão para o diagnóstico laboratorial da infecção pela síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2)3. A detecção molecular do SARS-CoV-2 é tipicamente baseada nos genes N (gene da proteína do nucleocapsídeo), E (gene da proteína do envelope) e RdRp (gene da RNA polimerase dependente de RNA) na região do gene ORF1a/b (quadro de leitura aberto 1a/b) identificada no genoma viral. Eles são considerados as principais regiões conservadas encontradas nos genomas virais para o reconhecimento do vírus4. Entre esses genes, os genes RdRp e E têm alta sensibilidade de detecção analítica, enquanto o gene N tem baixa sensibilidade analítica5.
O desempenho dos ensaios de PCR pode variar dependendo de vários fatores, como: reagentes de extração, reagentes de amplificação/detecção, método de extração, qualidade da máquina de PCR e outros instrumentos. Em abril de 2020, mais de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países receberam Autorização de Uso Emergencial (EUA) para diagnósticos de COVID-196. Na Etiópia, mais de 14 plataformas de PCR em tempo real são usadas para detecção de PCR de SARS-CoV-2 em 26 instituições de saúde pública, incluindo ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7. Além disso, vários kits de teste de PCR estão disponíveis, como o teste Daan Gene, o teste Abbott SARS-CoV-2, o teste Sansure Biotech e o teste SARS-CoV-2 BGI. Embora o rRT-PCR seja altamente sensível, alguns pacientes com COVID-19 relatam resultados falso-negativos devido a cópias insuficientes de ácido ribonucleico viral (RNA) em amostras devido à coleta, transporte, armazenamento e manuseio inadequados e testes laboratoriais. condições e ações do pessoal8. Além disso, o manuseio incorreto da amostra ou do controle, a configuração do limite de ciclo (Ct) e a reatividade cruzada com outros ácidos nucleicos patogênicos ou RNA SARS-CoV-2 inativo/residual podem levar a resultados falso-positivos em ensaios de rRT-PCR9. Assim, fica claro que os testes de PCR podem de fato identificar portadores de fragmentos de genes, já que eles não conseguem nem mesmo distinguir entre genes virais verdadeiramente ativos, de modo que os testes só conseguem identificar portadores e não pacientes10. Portanto, é importante avaliar o desempenho diagnóstico usando métodos padrão em nosso ambiente. Embora muitos reagentes NAAT estejam disponíveis no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) e em todo o país, nenhuma avaliação comparativa de sua eficácia foi relatada ainda. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho comparativo de kits disponíveis comercialmente para a detecção de SARS-CoV-2 por rRT-PCR usando amostras clínicas.
Um total de 164 participantes com suspeita de COVID-19 foram incluídos neste estudo. A maioria das amostras era proveniente de centros de tratamento (118/164 = 72%), enquanto os 46 participantes restantes (28%) eram de centros sem tratamento. Entre os participantes não tratados no centro, 15 (9,1%) tinham casos clinicamente suspeitos e 31 (18,9%) tinham contatos de casos confirmados. Noventa e três (56,7%) participantes eram do sexo masculino, e a média de idade (± DP) dos participantes era de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo, foram determinadas as taxas positivas e negativas de quatro testes para COVID-19. Assim, as taxas positivas do ensaio Abbott SARS-CoV-2, ensaio Daan Gene 2019-nCoV, ensaio SARS-CoV-2 BGI e ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foram de 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%, respectivamente. As pontuações positivas e negativas do padrão de referência composto (CRS) foram 97 (59,1%) e 67 (40,9%), respectivamente (Tabela 1). Neste estudo, a definição de CRS foi baseada na regra “qualquer positivo”, segundo a qual, de quatro resultados de teste, dois ou mais resultados de teste que deram o mesmo resultado foram considerados verdadeiros positivos ou negativos.
Neste estudo, encontramos uma concordância percentual negativa (NPA) de 100% (IC 95% 94,6-100) para todas as análises em comparação com a CRS. A análise da Sansure Biotechnology apresentou uma PPA mínima de 93,8% (IC 95% 87,2-97,1) e a análise do Daan Gene 2019-nCoV apresentou uma concordância geral de 99,4% (IC 95% 96,6-99,9). Em contraste, a concordância geral entre o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foi de 98,8% e 96,3%, respectivamente (Tabela 2).
O coeficiente de concordância kappa de Cohen entre os resultados do ensaio CRS e do ensaio Abbott SARS-CoV-2 foi totalmente consistente (K = 1,00). Da mesma forma, os valores kappa de Cohen detectados pelos ensaios Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV também são totalmente consistentes com CRS (K ≥ 0,925). Nesta análise comparativa, o teste qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que os resultados do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foram significativamente diferentes dos resultados do CRS (p = 0,031) (Tabela 2).
Conforme mostrado na Fig.1 a porcentagem do menor valor de Ct (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinados) foi de 87,6% e o valor de Ct do gene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem do valor de Ct baixo (< 20 Ct) foi de 50,3% e o valor de Ct alto (36–40 Ct) foi de 3,2%. 1 a porcentagem do menor valor de Ct (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinados) foi de 87,6% e o valor de Ct do gene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem do valor de Ct baixo (< 20 Ct) foi de 50,3% e o valor de Ct alto (36–40 Ct) foi de 3,2%.Conforme mostrado na Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) analisado Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp e N) obteve 87,6%, e Análise Ct de ORF1a/b da Sansure Biotech 2019-nCoV что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, a porcentagem da análise do menor valor de Ct (< 20 Ct) do Abbott SARS-CoV-2 (gene combinado RdRp e N) foi de 87,6%, e o valor de Ct da análise do gene ORF1a/b do Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem do valor de Ct baixo (< 20 Ct) foi responsável por 50,3%, e o valor de Ct alto (36–40 Ct) foi responsável por 3,2%.如图1 所示, Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%,高Ct 值(36–40 Ct) A taxa de crescimento é de 3,2%。 Conforme mostrado na Figura 1, a menor porcentagem de valor de Ct (< 20 Ct) do teste Abbott SARS-CoV-2 (combinação de RdRp e gene N) é de 87,6%, o valor de Ct do gene ORF1a/b do teste Sansure Biotech 2019-nCoV mostra uma baixa porcentagem de Ct (< 20 Ct) de 50,3%, e a porcentagem de Ct (36–40 Ct) de 3,2%. No caso do risco 1, analisamos o Abbott SARS-CoV-2 (com os genes RdRp e N) e o número de telefone celular Ct (< 20 Ct) na proporção de 87,6%, e um valor de Ct maior ORF1a/b em исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Conforme mostrado na Figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (combinando os genes RdRp e N) teve o menor valor percentual de Ct (< 20 Ct) em 87,6%, enquanto o valor de Ct do gene ORF1a/b no estudo Sansure Biotech 2019 – A análise do nCoV mostrou um baixo Ct. O valor percentual (< 20 Ct) custa 50,3%, e o valor percentual percentual (36–40 Ct) equivale a 3,2%. A porcentagem de valores (< 20 Ct) foi de 50,3%, e a porcentagem de valores altos de Ct (36–40 Ct) foi de 3,2%.O teste Abbott SARS-CoV-2 B registrou valores de Ct acima de 30. Por outro lado, no ensaio BGI SARS-CoV-2 o gene ORF1a/b apresentou um alto valor de Ct (> 36 Ct) e a porcentagem foi de 4% (Fig. 1). Por outro lado, no ensaio BGI SARS-CoV-2 o gene ORF1a/b apresentou um alto valor de Ct (> 36 Ct) e a porcentagem foi de 4% (Fig. 1). Para os medicamentos, na análise do BGI SARS-CoV-2, o ORF1a/b tem um valor de Ct (> 36 Ct), uma proporção maior que 4% (рис. 1). Por outro lado, na análise do gene BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b apresentou um alto valor de Ct (> 36 Ct), cuja porcentagem foi de 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Por outro lado, na detecção do BGI SARS-CoV-2, a porcentagem do gene ORF1a/b com alto valor de Ct (>36 Ct) é de 4% (Figura 1). Em comparação com outras drogas, na análise do BGI SARS-CoV-2, o gene ORF1a/b é medido em Ct (>36 Ct) 4% (riso 1). Por outro lado, na análise BGI SARS-CoV-2, a porcentagem de genes ORF1a/b com altos valores de Ct (>36 Ct) foi de 4% (Fig. 1).
Neste estudo, coletamos 164 amostras nasofaríngeas. Para todos os tipos de ensaios, o isolamento e a amplificação do RNA foram realizados utilizando os métodos e kits recomendados pelos respectivos fabricantes.
Este estudo demonstrou que o teste Abbott para SARS-CoV-2 tem o mesmo desempenho de detecção que o CRS, com 100% de concordância positiva, negativa e geral. A concordância kappa de Cohen é 1,00, indicando concordância total com o CRS. Um estudo semelhante da Universidade de Washington, nos EUA, descobriu que a sensibilidade e a especificidade gerais do teste Abbott para SARS-CoV-2 foram de 93% e 100%, respectivamente, em comparação com o ensaio determinado em laboratório (LDA) do CDC. 11. O sistema de detecção Abbott SARS-CoV-2 é baseado na detecção combinada simultânea dos genes N e RdRp, pois ambos os genes são mais sensíveis, minimizando falsos negativos12. Um estudo em Viena, Áustria, também mostrou que grandes volumes de amostra de extração e volumes de eluente de detecção minimizaram os efeitos de diluição e aumentaram a eficiência da detecção13. Assim, a combinação perfeita da Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pode ser associada a um sistema de detecção de plataforma que detecta simultaneamente genes combinatórios, extrai um grande número de amostras (0,5 ml) e usa uma grande quantidade de eluente (40 µl).
Nossos resultados também mostraram que o desempenho de detecção do teste genético Daan foi quase o mesmo que o do CRS. Isso é consistente com um estudo14 conduzido na Universidade de Anhui, em Huainan, China, e com a alegação do fabricante de 100% de concordância positiva. Apesar dos relatos de resultados consistentes, uma amostra apresentou falso negativo após o novo teste com o mesmo eluato, mas foi positiva nos ensaios Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019. Isso sugere que pode haver variabilidade nos resultados entre os diferentes tipos de ensaios. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação ao ensaio de referência definido em laboratório. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação ao ensaio de referência definido em laboratório. Isso não é verdade, no teste, provado na Kita15, resultado da análise de Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от é um laboratório de referência anália. Entretanto, em um estudo na China15, o resultado da análise de Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) da análise de referência do laboratório.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p <0,05）。然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, provado em Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) por сравнению с его teste de laboratório эталонным. Entretanto, em um estudo na China15, os resultados do teste genético de Daan foram significativamente diferentes (p < 0,05) em comparação ao seu teste de laboratório de referência.Essa discrepância pode ser devido à sensibilidade do teste de referência para detectar SARS-CoV-2, e estudos adicionais podem ser importantes para determinar a causa.
Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho comparativo do ensaio SARS-CoV-2 BGI com CRS, mostrando excelente concordância percentual positiva (PPA = 97,9%), concordância percentual negativa (NPA = 100%) e concordância percentual geral por gênero (OPA). ). = 98,8%). Os valores de Kappa de Cohen mostraram boa concordância (K = 0,975). Estudos na Holanda16 e na China15 mostraram resultados consistentes. O teste SARS-CoV-2 BGI é um teste de detecção de gene único (ORF1a/b) usando eluato de amplificação/detecção de 10 µl. Apesar da boa concordância estatística com nossos resultados de referência, a análise perdeu duas amostras positivas (1,22%) da amostra total. Isso pode ter enormes implicações clínicas para a dinâmica de transmissão nos níveis do paciente e da comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensaio Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); a porcentagem geral de correspondência foi de 96,3%. A força de concordância também foi determinada pelo valor de Kappa de Cohen, que foi de 0,925, indicando concordância total com o CRS. Novamente, nossos resultados são idênticos aos de estudos conduzidos na Universidade Central do Sul em Changsha, China, e no Departamento de Laboratório Clínico do Hospital Popular de Liuzhou, na cidade de Liuzhou, China17. Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste qui-quadrado (teste de MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao CRS (p < 0,005). Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste qui-quadrado (teste de MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao CRS (p < 0,005). Não é isso que é uma questão de segurança para você, critérios хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性, 但卡方检验（MacNemar 检验）表明, Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 , 但 检验 （(macnemar 检验 表明 , , sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） A maneira mais fácil de usar suas estatísticas é o que significa que você precisa de um critério de criptografia (critério Macnemaра) estatísticas de escala A proporção positiva (p < 0,005) foi analisada pela Sansure Biotech e CRS. Apesar da boa concordância estatística observada acima, o teste qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou uma diferença estatisticamente significativa (p < 0,005) entre o ensaio Sansure Biotech e o CRS.Seis amostras (3,66%) apresentaram falsos negativos em comparação com a CRS (Tabela Suplementar 1); isso é muito importante, especialmente considerando a dinâmica de transmissão do vírus. Os dados acima também corroboram essa baixa taxa de detecção15.
Neste estudo, os valores de Ct foram determinados para cada ensaio e respectiva plataforma, com o menor valor médio de Ct relatado no ensaio Abbott SARS-CoV-2. Este resultado pode estar relacionado ao sistema de testes genéticos combinados simultâneos da Abbott para a detecção de SARS-CoV-2. Portanto, de acordo com a Figura 1, 87,6% dos resultados do Abbott SARS-CoV-2 apresentaram valores de Ct abaixo de 20. Apenas um pequeno número de resultados de amostra (12,4%) estava na faixa de 20-30. Valores de Ct acima de 30 não foram registrados. Além do uso do formato de teste genético do painel SARS-CoV-2 pela Abbott, este resultado pode estar relacionado ao limite inferior de detecção (32,5 cópias de RNA/mL)18, que é três vezes menor do que o limite inferior da empresa de 100 cópias de RNA/mL. ml)19.
Este estudo apresenta algumas limitações: em primeiro lugar, não dispomos de métodos padrão/de referência [como carga viral ou outros testes laboratoriais (LDA)] devido à falta de recursos. Em segundo lugar, todas as amostras utilizadas neste estudo foram swabs nasofaríngeos, enquanto os resultados não foram aplicáveis ​​a outros tipos de amostras; e, em terceiro lugar, o tamanho da nossa amostra foi pequeno.
Este estudo comparou o desempenho de quatro ensaios de rRT-PCR para SARS-CoV-2 utilizando amostras nasofaríngeas. Todos os ensaios de detecção apresentaram desempenho quase comparável, com exceção do ensaio da Sansure Biotech. Além disso, a baixa taxa de positividade foi identificada no ensaio Sansure Biotech em comparação ao CRS (p < 0,05). Além disso, a baixa taxa de positividade foi identificada no ensaio Sansure Biotech em comparação ao CRS (p < 0,05). Além disso, no teste Sansure Biotech, você pode obter resultados positivos com CRS (p < 0,05). Além disso, o teste Sansure Biotech apresentou baixa porcentagem de resultados positivos em comparação ao CRS (p < 0,05).此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Além disso, a Sansure Biotech analisou os resultados mais positivos do CRS (p < 0,05). Além disso, o ensaio Sansure Biotech teve uma taxa de positividade menor em comparação ao CRS (p < 0,05).A análise de PPA, NPA e concordância geral do ensaio Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) excedeu 93,5%, com um valor de força de concordância Cohen Kappa de 0,925. Por fim, o ensaio Sansure Biotech (RUO) precisa de validação adicional para uso na Etiópia, e pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar as alegações de fabricantes individuais.
O delineamento do estudo comparativo foi conduzido em quatro unidades de saúde em Addis Ababa, o Hospital Eka Kotebe, o Millennium Church Treatment Centre, o Zewooditu Memorial Hospital e o St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Os dados foram coletados entre 1 e 31 de dezembro de 2020. As unidades médicas para este estudo foram escolhidas propositalmente com base no alto número de casos e na disponibilidade dos principais centros de tratamento na cidade. Da mesma forma, os instrumentos, incluindo os instrumentos de PCR em tempo real ABI 7500 e Abbott m2000, foram selecionados de acordo com as recomendações dos fabricantes de reagentes NAAT, e quatro kits de detecção de PCR foram selecionados para este estudo, já que a maioria dos laboratórios na Etiópia utilizou pelo menos quatro deles. Teste genético, teste Abbott SARS-CoV-2, teste Sansure Biotech e teste SARS-CoV-2 BGI foram realizados durante o estudo).
O teste para SARS-CoV-2 foi realizado de 1 a 30 de dezembro de 2020 usando 3 ml de Meio de Transporte Viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de indivíduos sob investigação para COVID-19 encaminhados ao EPHI. Amostras nasofaríngeas foram coletadas por coletores de amostras treinados e enviadas ao EPHI em embalagens triplas. Antes do isolamento do ácido nucleico, cada amostra recebe um número de identificação exclusivo. A extração é realizada de cada amostra imediatamente após a chegada usando métodos de extração manual e automática. Assim, para a extração automática do Abbott m2000, 1,3 ml (incluindo 0,8 ml de volume morto e 0,5 ml de volume de entrada de extração) da amostra foi extraído de cada amostra e passado pelo Sistema de Preparação de Amostras de DNA Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA). ) Um lote de 96 [92 amostras, dois controles de detecção e dois controles não-template (NTC)] foi incluído no processo geral (recuperação e detecção) de duas rodadas de SARS-CoV-2 (EUA) em tempo real. mineração. Da mesma forma, para extração manual, use as mesmas amostras (para extração e descoberta automáticas). Assim, ao longo do processo, amostras de 140 µl foram aliquotadas e extraídas usando o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) em lotes de 24 (incluindo 20 amostras, dois controles de ensaio e dois NTCs) ao longo de nove rodadas. Os eluatos extraídos manualmente foram amplificados e detectados usando um termociclador ABI 7500 usando o ensaio SARS-CoV-2 BGI, ensaio Daan Gene e ensaio Sansure Biotech.
O isolamento e a purificação automatizados do RNA viral do SARS-CoV-2 seguem o princípio da esfera magnética usando reagentes de preparação de amostras de DNA da Abbott. A inativação das amostras e a solubilização das partículas virais são realizadas usando um detergente contendo isotiocianato de guanidina para desnaturar a proteína e inativar a RNase. O RNA é então separado da proteína por separação em fase sólida usando sílica, ou seja, o sal de guanidínio e o pH alcalino do tampão de lise promovem a ligação dos ácidos nucleicos à sílica (SiO2). A etapa de enxágue remove as proteínas e os detritos restantes para produzir uma solução límpida. O RNA transparente é isolado de micropartículas à base de sílica usando o campo magnético do instrumento20,21. Por outro lado, o isolamento e a purificação manuais do RNA são realizados pelo método da coluna de centrifugação usando centrifugação em vez de um suporte magnético e separação das micropartículas do eluente.
O Teste de Detecção de SARS-CoV-2 em Tempo Real Abbott (Abbott Molecular, Inc.) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, que recebeu EUA19,22 da OMS e FDA. Neste protocolo, a inativação da amostra antes da extração foi realizada em banho-maria a 56 °C por 30 min. Após a inativação do vírus, a extração do ácido nucleico foi realizada em um instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM usando um sistema de preparação de amostra de DNA Abbott m2000. de acordo com o fabricante. A amplificação e a detecção foram realizadas usando um instrumento Abbott m2000 RT-PCR, e a detecção dupla foi realizada para os genes RdRp e N. ROX) e VIC P (corante proprietário) para direcionamento e detecção de controles internos, permitindo a detecção simultânea de ambos os produtos de amplificação 19 .
O método de detecção de amplificação deste kit baseia-se na tecnologia RT-PCR de uma etapa. Os genes ORF1a/b e N foram selecionados como regiões conservadas pela Daan Gene Technology para detectar a amplificação da região alvo. Primers específicos e sondas fluorescentes (sondas do gene N marcadas com FAM, sondas ORF1a/b marcadas com VIC) foram projetados para detectar o RNA do SARS-CoV-2 em amostras. O eluente final e as misturas principais foram preparados adicionando 5 µl de eluente a 20 µl da mistura principal, totalizando 25 µl. A amplificação e a detecção foram realizadas simultaneamente em um instrumento de PCR em tempo real ABI 750024.
Os genes ORF1a/b e N foram detectados utilizando o Kit de Diagnóstico de Ácido Nucleico Sansure Biotech nCoV-2019 (detecção por PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada gene-alvo selecionando o canal FAM para a região ORF1a/b e o canal ROX para o gene N. A este kit de ensaio, os reagentes eluente e master mix são adicionados da seguinte forma: prepare 30 µl de reagente master mix e 20 µl de amostra eluída para detecção/amplificação. A PCR em tempo real ABI 750025 foi utilizada para amplificação/detecção.
O teste BGI para SARS-CoV-2 é um kit de rRT-PCR fluorescente em tempo real para o diagnóstico da COVID-19. A região-alvo está localizada na região ORF1a/b do genoma do SARS-CoV-2, que é um método de detecção de gene único. Além disso, o gene de manutenção humana β-actina é um gene-alvo regulado internamente. A mistura principal é preparada misturando 20 µl do reagente da mistura principal e 10 µl da amostra de RNA extraída em uma placa de poços26. Um instrumento de PCR quantitativo fluorescente em tempo real ABI 7500 foi utilizado para amplificação e detecção. Todas as amplificações de ácido nucleico, as condições de execução da PCR para cada ensaio e a interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com as instruções do respectivo fabricante (Tabela 3).
Nesta análise comparativa, não usamos o método padrão de referência para determinar a porcentagem de concordância (positiva, negativa e geral) e outros parâmetros de comparação para as quatro análises. Cada comparação de teste foi feita com CRS, neste estudo o CRS foi definido pela regra "qualquer positivo" e o resultado foi determinado, não por um único teste, usamos pelo menos dois resultados de teste correspondentes. Além disso, no caso de transmissão de COVID-19, resultados falso-negativos são mais perigosos do que resultados falso-positivos. Portanto, para dizer "positivo" com a maior precisão possível de um resultado CRS, pelo menos dois testes de ensaio devem ser positivos, o que significa que pelo menos um resultado positivo provavelmente virá de um ensaio EUA. Assim, de quatro resultados de teste, dois ou mais resultados de teste que dão o mesmo resultado são considerados verdadeiros positivos ou negativos18,27.
Os dados foram coletados por meio de formulários estruturados de extração de dados, a entrada e a análise dos dados foram realizadas utilizando o software estatístico Excel e o SPSS versão 23.0 para estatística descritiva. Foram analisadas as concordâncias positivas, negativas e percentuais gerais, e um escore Kappa foi utilizado para determinar o grau de concordância de cada método com a ERC. Os valores de Kappa são interpretados da seguinte forma: 0,01 a 0,20 para concordância leve, 0,21 a 0,40 para concordância geral, 0,41-0,60 para concordância moderada, 0,61-0,80 para concordância maior e 0,81-0,99 para concordância completa28.
A autorização ética foi obtida da Universidade de Adis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foram aprovados pelo Conselho de Ética Científica do Instituto de Saúde Pública da Etiópia. O número de referência para a Licença de Ética EPHI é EPHI/IRB-279-2020. Todos os métodos foram aplicados de acordo com as recomendações e disposições das Diretrizes Nacionais Abrangentes da Etiópia para o Tratamento da COVID-19. Além disso, o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo antes da participação no estudo.
Todos os dados obtidos ou analisados ​​neste estudo estão incluídos neste artigo publicado. Os dados que corroboram os resultados deste estudo estão disponíveis junto ao respectivo autor mediante solicitação razoável.
Organização Mundial da Saúde. Recomendações para Estratégias de Testes Laboratoriais para COVID-19: Orientação Interina, 21 de março de 2020, nº WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
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