Desempenho de quatro ensaios de amplificação de ácido nucleico para identificar SARS-CoV-2 na Etiópia

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Desde o surto de doença de coronavírus de 2019 (Covid-19), muitos testes de amplificação de ácido nucleico comercial (NAATS) foram desenvolvidos em todo o mundo e se tornaram ensaios padrão. Embora vários testes tenham sido rapidamente desenvolvidos e aplicados a testes de diagnóstico de laboratório, o desempenho desses testes não foi avaliado em uma variedade de configurações. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho dos ensaios de biotecnologia de Abbott SARS-CoV-2, Daan, BGI e Sansure usando o padrão de referência composto (CRS). O estudo foi realizado no Instituto de Saúde Pública da Etiópia (EPHI) de 1 a 30 de dezembro de 2020. 164 amostras nasofaríngeas foram extraídas usando o Kit Mini Qiaamp RNA e o sistema de preparação de amostra de DNA de Abbott. Dos 164 espécimes, 59,1% foram positivos e 40,9% foram negativos para a SRC. A positividade da biotecnologia sansure foi significativamente baixa em comparação com a CRS (p <0,05). A positividade da biotecnologia sansure foi significativamente baixa em comparação com a CRS (p <0,05). Положитеные р пллаты sansure biotecn ыыth значитерьно нижж по сра braв с с crs (p <0,05). Os resultados positivos da Sansure Biotech foram significativamente menores em comparação com o CRS (p <0,05).与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低 （P <0,05）。。与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低 （P <0,05）。。 O sansure biotech ыыыы ззначитеньно меншш политеvio м м политеich м полferir политеiliar O Sansure Biotech teve significativamente menos resultados positivos em comparação com o CRS (p <0,05).A concordância geral das quatro análises foi de 96,3-100% em comparação com a CRS. Além da baixa taxa de positividade do ensaio de biotecnologia sansure, o desempenho dos quatro ensaios foi quase comparável. Como tal, o ensaio Sansure Biotech [Somente de pesquisa (RUO)] requer validação adicional para seu uso na Etiópia. Finalmente, pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar os ensaios com as reivindicações do fabricante apropriadas.
Os testes de laboratório fazem parte do Plano Estratégico da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a Doença do Coronavírus 2019 (Covid-19) Preparação e Resposta (SPRP). Quem aconselha que os países precisam construir capacidade laboratorial para melhorar a preparação, o gerenciamento adequado de casos, a vigilância e a rápida resposta aos desafios da saúde pública. Isso sugere que o papel do laboratório é essencial para caracterizar a doença e a epidemiologia de agentes infecciosos emergentes e controlar sua propagação.
O diagnóstico de covid-19 requer informações epidemiológicas e médicas, sintomas/sinais pessoais e dados radiográficos e laboratoriais2. Desde que o surto Covid-19 foi relatado em Wuhan, China, muitos testes de amplificação de ácido nucleico comercial (NAATS) foram desenvolvidos em todo o mundo. A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa em tempo real (RRT-PCR) tem sido usada como um método de rotina e padrão para diagnóstico laboratorial de infecção grave respiratória aguda e aguda 2 (SARS-COV-2) 3. A detecção molecular de SARS-CoV-2 é tipicamente baseada no gene de N (gene da proteína nucleocapsídeo), E (gene da proteína envelope) e RDRP (gene da RNA polimerase dependente de RNA) em ORF1A/B (estrutura de leitura aberta 1A/B). Gene) região identificada do genoma viral. Eles são considerados as principais regiões conservadas encontradas em genomas virais para reconhecimento de vírus4. Entre esses genes, os genes RDRP e E apresentam alta sensibilidade à detecção analítica, enquanto o gene N tem baixa sensibilidade analítica5.
O desempenho dos ensaios de PCR pode variar dependendo de vários fatores, como: reagentes de extração, reagentes de amplificação/detecção, método de extração, qualidade da máquina de PCR e outros instrumentos. Em abril de 2020, mais de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países receberam autorização de uso de emergência (UEA) para o diagnóstico da CoVID-196. Na Etiópia, mais de 14 plataformas de PCR em tempo real são usadas para detecção de PCR de SARS-CoV-2 em 26 instituições de saúde públicas, incluindo ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 e Quant-Studio7. Além disso, vários kits de teste de PCR estão disponíveis, como teste de gene Daan, teste de abbott sars-cov-2, teste de biotecnologia de sansure e teste BGI SARS-COV-2. Embora a RRT-PCR seja altamente sensível, alguns pacientes com covid-19 relatam resultados falsos negativos devido a cópias insuficientes do ácido ribonucleico viral (RNA) em amostras devido a coleta, transporte, armazenamento e manuseio inadequados e testes de laboratório. Condições e ações do pessoal8. Além disso, amostra ou controle de manuseio, limiar de ciclo (CT) e reatividade cruzada com outros ácidos nucleicos patogênicos ou RNA SARS-CoV-2 inativo/residual pode levar a resultados falsos positivos em ensaios de RRT-PCR9. Assim, é claro que os testes de PCR podem realmente identificar portadores de fragmentos de genes, pois eles não podem nem distinguir entre genes virais verdadeiramente ativos, para que os testes possam identificar apenas portadores e não pacientes10. Portanto, é importante avaliar o desempenho de diagnóstico usando métodos padrão em nossa configuração. Embora muitos reagentes NAAT estejam disponíveis no Instituto de Saúde Pública Etiópia (EPHI) e em todo o país, ainda não foi relatada uma avaliação comparativa de sua eficácia. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho comparativo de kits disponíveis comercialmente para a detecção de SARS-CoV-2 por RRT-PCR usando espécimes clínicos.
Um total de 164 participantes com suspeita de Covid-19 foram incluídos neste estudo. A maioria das amostras era de centros de tratamento (118/164 = 72%), enquanto os 46 (28%) restantes eram de centros de não tratamento. Entre os participantes não tratados no centro, 15 (9,1%) tiveram casos clinicamente suspeitos e 31 (18,9%) tiveram contatos de casos confirmados. Noventa e três (56,7%) participantes eram do sexo masculino e a idade média (± DP) dos participantes foi de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo, foram determinadas taxas positivas e negativas de quatro testes para o CoVID-19. Assim, as taxas positivas do ensaio de Abbott SARS-CoV-2, o ensaio do Gene Daan 2019-NCOV, o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-NCOV foram 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%, respectivamente. Os escores de referência composta positiva e negativa (CRS) foram 97 (59,1%) e 67 (40,9%), respectivamente (Tabela 1). Neste estudo, a definição de CRS foi baseada na regra "positiva", em que dos quatro resultados dos testes, dois ou mais resultados de testes que deram o mesmo resultado foram considerados verdadeiros positivos ou negativos.
Neste estudo, encontramos um acordo percentual negativo (NPA) de 100% (IC 95% 94,6-100) para todas as análises em comparação com a SRC. A análise de biotecnologia de Sansure mostrou um PPA mínimo de 93,8% (IC 95% 87.2-97.1) e a análise do gene Daan 2019-NCOV teve uma concordância geral de 99,4% (95% IC 96.6-99.9). Por outro lado, a concordância geral entre o ensaio BGI SARS-COV-2 e o ensaio Sansure Biotech 2019-NCOV foi de 98,8% e 96,3%, respectivamente (Tabela 2).
O coeficiente de concordância Kappa de Cohen entre os resultados do ensaio de CRS e Abbott SARS-CoV-2 foi totalmente consistente (k = 1,00). Da mesma forma, os valores de Kappa de Cohen detectados pelos genes Daan 2019-NCOV, SARS-COV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-NCOV também são totalmente consistentes com o CRS (k ≥ 0,925). Nesta análise comparativa, o teste do qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que os resultados do ensaio sansure Biotech 2019-NCOV foram significativamente diferentes dos resultados do CRS (p = 0,031) (Tabela 2).
Como mostrado na FIG.1 A porcentagem do menor valor de TC (<20 ct) do ensaio de abbott sars-cov-2 (gene rdRP e n combinado) foi de 87,6% e o valor do gene de ORF1a/b de valor de CT de Sansure Biotech foi 50% e o ensaio de 3 36 anos. 1 A porcentagem do menor valor de TC (<20 ct) do ensaio de abbott sars-cov-2 (gene rdRP e n combinado) foi de 87,6% e o valor do gene de ORF1a/b de valor de CT de Sansure Biotech foi 50% e o ensaio de 3 36 anos.Como mostrado na FIG.1, п marcha з п п п п п п п п прцц на нечч нееч аечч аÉ значения ct (<20 ct) a abbott sars-cov-2 (коминиntos и иии 8 аи аиthл ии аии аии 8 а аTлзый аии 8 аии esa знача Abbott Sars-Cov-2 (к и edade Orf1a/b анал mundo Sansure Biotech 2019-NCov поазазала ччч прцент ногого значенeir CT (<20 ct) сс сс с 36 сы ct (<20 ct) сс сс сы сы сы сы с 36 с 36 с 36 с с) с з зы с с) с з зы с с) с з з с 36 ct (<20 ct). соталяяя 3,2%. 1, a porcentagem do valor mais baixo da CT (<20 CT) de Abbott SARS-COV-2 (RDRP do gene combinado e N) foi de 87,6%, e o valor de CT do ORF1A/B Análise de SANSure BiOtech 2019-NCov mostrou que a percentagem de valor de CT baixo (<20 CT) em 50.3%e 36%em relação a 50.3%em relação a 50%e 36%de valor de Biotech 2019.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50.3%，高Ct 值(36–40 Ct) 的百分比为3.2%。 As shown in Figure 1, the lowest Ct value percentage (< 20 Ct) of Abbott SARS-CoV-2 test (combination of RdRp and N gene) is 87.6%, the ORF1a/b gene Ct value of Sansure Biotech 2019-nCoV test shows low Ct值(< 20 Ct) 的 percentage is 50.3%, 高Ct 值(36–40 Ct) 的 percentage is 3.2%. Как показано н н н ноозазано н ниннн а а ABBOTT SARS-COV-2 (сччющающий ге rdrp и) ие ие ие и )е и) и) иее и) 20 и) ие 20 и) ие и) и) се счыы с )ы сч с) 87,6%, a а аначение ct г orf1a/b и ис иSure Biotech 2019- ананазз пооазаза з ife. Conforme mostrado na Figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (combinando os genes RDRP e N) teve o menor valor de TC porcentagem (<20 CT) a 87,6%, enquanto o valor da TC do gene orf1a/b no estudo SANSure Biotech 2019-a análise do NCOV mostrou um baixo teormo. П п п пnchццт значений (<20 ct) escol 50,3%, a а процент ыыыих з pap (36-40 ct) ссавbol 3,2%. A porcentagem de valores (<20 CT) foi de 50,3%e a porcentagem de altos valores de TC (36-40 CT) foi de 3,2%.O teste Abbott SARS-CoV-2 B registrou valores de TC acima de 30. Por outro lado, no ensaio BGI SARS-COV-2 ORF1A/B O gene teve um alto valor de TC (> 36 ct) foi de 4% (Fig. 1). Por outro lado, no ensaio BGI SARS-COV-2 ORF1A/B O gene teve um alto valor de TC (> 36 ct) foi de 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 1). Por outro lado, na análise do gene BGI SARS-CoV-2 ORF1a/B teve um alto valor de TC (> 36 ct), cuja porcentagem foi de 4% (Fig. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-COV-2 检测中 ， ORF1A/B 基因具有高 CT 值 （> 36 CT） 的百分比为 4%（图 1）。。 Por outro lado, na detecção BGI SARS-COV-2, a porcentagem do gene orf1a/b com alto valor de TC (> 36 CT) é de 4% (Figura 1). Д дрй с с с с с с с с с а с а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а o Bgi sars-cov-cov-2 пенто orf1a/b с ы иses. Por outro lado, na análise BGI SARS-COV-2, a porcentagem de genes ORF1A/B com altos valores de TC (> 36 CT) foi de 4% (Fig. 1).
Neste estudo, coletamos 164 amostras nasofaríngeas. Para todos os tipos de ensaios, o isolamento e a amplificação do RNA foram realizados usando os métodos e kits recomendados pelos respectivos fabricantes.
Este estudo demonstrou que o teste de Abbott para SARS-COV-2 tem o mesmo desempenho de detecção que o CRS, com 100% positiva, negativa e concordância geral. O Contrato Kappa de Cohen é de 1,00, indicando contrato completo com a CRS. Um estudo semelhante da Universidade de Washington nos EUA descobriu que a sensibilidade geral e a especificidade do teste de Abbott para SARS-CoV-2 foi de 93% e 100%, respectivamente, em comparação com o ensaio determinado por laboratório (LDA) do CDC. 11. O sistema de detecção Abbott SARS-CoV-2 é baseado na detecção combinada simultânea dos genes N e RDRP, pois ambos os genes são mais sensíveis, minimizando falsos negativos12. Um estudo em Viena, na Áustria, também mostrou que grandes volumes de amostra de extração e volumes eluentes de detecção minimizaram efeitos de diluição e aumento da eficiência de detecção13. Assim, a correspondência perfeita de Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pode estar associada a um sistema de detecção de plataforma que detecta simultaneamente genes combinatórios, extrai um grande número de amostras (0,5 mL) e usa uma grande quantidade de eluente (40 µl).
Nossos resultados também mostraram que o desempenho da detecção do teste genético de Daan foi quase o mesmo que o do CRS. Isso é consistente com um estudo14 realizado na Universidade de Anhui, em Huainan, China, e com a reivindicação do fabricante de 100% de acordo positivo. Apesar dos relatos de resultados consistentes, uma amostra foi falsa negativa após o teste do mesmo eluato, mas foi positivo nos ensaios Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech NCOV-2019. Isso sugere que pode haver variabilidade nos resultados em diferentes tipos de ensaios. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio do gene Daan foi significativamente diferente (p <0,05) em comparação com o ensaio de referência definido por laboratório. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio do gene Daan foi significativamente diferente (p <0,05) em comparação com o ensaio de referência definido por laboratório. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их л aT da этаÍ seguir. No entanto, em um estudo na China15, o resultado da análise do gene Daan foi significativamente diferente (p <0,05) de sua análise de referência laboratorial.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异 （p <0,05）。。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. No entanto, em um estudo na China15, os resultados do teste genético de Daan foram significativamente diferentes (p <0,05) em comparação com seu teste laboratorial de referência.Essa discrepância pode ser devida à sensibilidade do teste de referência para detectar SARS-CoV-2, e estudos adicionais podem ser importantes para determinar a causa.
Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho comparativo do ensaio BGI SARS-CoV-2 com o CRS, mostrando excelente concordância percentual positiva (PPA = 97,9%), concordância percentual negativa (NPA = 100%) e concordância percentual geral por gênero (OPA). ). = 98,8%). Os valores de Kappa de Cohen mostraram boa concordância (k = 0,975). Estudos na Holanda16 e China15 mostraram resultados consistentes. O teste SARS-CoV-2 BGI é um teste de detecção de gene único (ORF1A/B) usando 10 µL de amplificação/eluato de detecção. Apesar da boa concordância estatística com nossos resultados de referência, a análise perdeu duas amostras positivas (1,22%) da amostra total. Isso pode ter enormes implicações clínicas para a dinâmica da transmissão nos níveis do paciente e da comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensaio Sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO); A porcentagem geral de correspondência foi de 96,3%. A força do acordo também foi determinada pelo valor Kappa de Cohen, que foi de 0,925, indicando concordância completa com o CRS. Novamente, nossos resultados são idênticos aos estudos realizados na Central South University, em Changsha, China, e no Departamento de Laboratório Clínico do Hospital Popular Liuzhou, Liuzhou City, China17. Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste do qui-quadrado (teste de MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio de biotecnologia sansure teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação com a CRS (p <0,005). Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste do qui-quadrado (teste de MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio de biotecnologia sansure teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação com a CRS (p <0,005). Н ноот н норт н нччт н нччч нth ччзииоnder ччзииафиафафаiliar (критерий манемbolа) поазазал, чч р лlus ат азала ч a biotecn ичч а <p p а <cr p ат азh A, ччзз а <cr ат аз A, ччззh и <и <ат аз A, ччз а <ат аз A, чч плззh и <и <ат аз A, ччзз а <з ат азз а furлh, чч а <атчзззh a biotecn и и и <а <а <ат ат аз з ат аз ч аз ч аззh аHoTech и и и <ат аз A, ччз а <peso 0,005). Embora o bom acordo estatístico acima tenha sido registrado, o teste do qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que o resultado do ensaio de biotecnologia sansure teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação com o CRS (p <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验 （MacNemar 检验） 表明 ， Sansure Biotech 检测的结果与 CRS 相比具有统计学显着差异 （P <0,005）。。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs 相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Неоттт н тччечное х хх х нхч нхч нхчч ês хх хх хх ышхх ышхх ышх ышх ышх ышхл сл сх ышхл сл сх ышх ышх ышхх ышх ышхх ышх нхх нхх нхх нхчч нччч itante т da значимю сназззницe (p <0,005) меж аácл ззом sansure biotecn и crs. Apesar do bom acordo estatístico mencionado acima, o teste do qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou uma diferença estatisticamente significativa (p <0,005) entre o ensaio de biotecnologia sansure e o CRS.Verificou -se que seis amostras (3,66%) são falsas negativas em comparação com a CRS (Tabela 1 suplementar); Isso é muito importante, especialmente dada a dinâmica da transmissão do vírus. Os dados acima também suportam essa baixa taxa de detecção15.
Neste estudo, os valores de TC foram determinados para cada ensaio e respectiva plataforma, com o menor valor médio de TC relatado no ensaio Abbott SARS-CoV-2. Esse resultado pode estar relacionado ao sistema de teste genético combinado simultâneo de Abbott para a detecção de SARS-CoV-2. Portanto, de acordo com a Figura 1, 87,6% dos resultados de Abbott SARS-CoV-2 tiveram valores de TC abaixo de 20. Apenas um pequeno número de resultados da amostra (12,4%) estava na faixa de 20 a 30. Os valores de TC acima de 30 não foram registrados. Além do uso de Abbott do formato de teste genético do painel SARS-COV-2, esse resultado pode estar relacionado ao limite de detecção mais baixo (32,5 cópias de RNA/ml) 18, que é três vezes menor que o limite inferior da empresa de 100 cópias de RNA/ml. ml) 19.
Este estudo tem algumas limitações: em primeiro lugar, não temos métodos padrão/de referência [como carga viral ou outros testes de laboratório (LDA)] devido à falta de recursos. Segundo, todos os espécimes utilizados neste estudo foram swabs nasofaríngeos, enquanto os resultados não foram aplicáveis ​​a outros tipos de amostra e, terceiro, nosso tamanho de amostra era pequeno.
Este estudo comparou o desempenho de quatro ensaios de RRT-PCR para SARS-CoV-2 usando amostras nasofaríngeas. Todos os ensaios de detecção tiveram desempenho quase comparável, com exceção do ensaio de biotecnologia de sansure. Além disso, a baixa taxa de positividade foi identificada no ensaio de biotecnologia sansure em comparação com o CRS (p <0,05). Além disso, a baixa taxa de positividade foi identificada no ensaio de biotecnologia sansure em comparação com o CRS (p <0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Além disso, o teste de biotecnologia sansure mostrou uma baixa porcentagem de resultados positivos em comparação com a SRC (p <0,05).此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0,05)。此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Além disso, o ensaio de biotecnologia sansure teve uma menor taxa de positividade em comparação com o CRS (p <0,05).A análise Sansure Biotech NCOV-2019 (RUO) da PPA, NPA e concordância geral excederam 93,5% com um valor de força de concordância de uma força de concordância Cohen Kappa de 0,925. Finalmente, o ensaio Sansure Biotech (RUO) precisa de uma validação adicional para uso na Etiópia, e pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar reivindicações de fabricantes individuais.
O desenho comparativo do estudo foi realizado em quatro instalações de saúde no Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Center, Zewooditu Memorial Hospital e Hospital Especialista em Tuberculose de São Pedro. Os dados foram coletados entre 1 e 31 de dezembro de 2020. As instalações médicas para este estudo foram propositadamente escolhidas com base no alto número de casos e na disponibilidade dos principais centros de tratamento da cidade. Da mesma forma, os instrumentos, incluindo os instrumentos de PCR em tempo real do ABI 7500 e Abbott M2000, foram selecionados de acordo com as recomendações dos fabricantes de reagentes NAAT, e quatro kits de detecção de PCR foram selecionados para este estudo, pois a maioria dos laboratórios na Etiópia usava pelo menos quatro deles. Teste de genes, teste de Abbott SARS-COV-2, teste de biotecnologia de sansure e teste BGI SARS-CoV-2 realizado durante o estudo).
Os testes para SARS-CoV-2 foram realizados de 1 a 30 de dezembro de 2020 usando 3 ml de meio de transporte viral (VTM) (Tecnologia Miraclean, Shenzhen, China) de indivíduos sob investigação para a Covid-19 se referiu à EPHI. As amostras nasofaríngeas foram coletadas por coletores de amostra treinados e enviados para Ephi em pacotes triplos. Antes do isolamento do ácido nucleico, cada amostra recebe um número de identificação exclusivo. A extração é realizada de cada amostra imediatamente após a chegada usando métodos de extração manual e automática. Assim, para a extração automática de Abbott M2000, 1,3 mL (incluindo volume morto de 0,8 mL e volume de entrada de extração de 0,5 ml) da amostra foi extraído de cada amostra e passada pelo sistema de preparação de amostra de DNA Abbott (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, EUA). ) Um lote de 96 [92 amostras, dois controles de detecção e dois controles não-templos (NTC)] foi incluído no processo geral (recuperação e detecção) de duas rodadas de SARS-CoV-2 (EUA) em tempo real. mineração. Da mesma forma, para extração manual, use as mesmas amostras (para extração e descoberta automáticas). Assim, durante todo o processo, 140 µl de amostras foram alíquotas e extraídas usando o kit de Mini RNA viral Qiaamp (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) em lotes de 24 (incluindo 20 amostras, dois controles de ensaio e dois NTCs) mais de nove rodadas. Os eluatos extraídos manualmente foram amplificados e detectados usando um ciclador térmico ABI 7500 usando o ensaio BGI SARS-CoV-2, ensaio de genes Daan e ensaio de biotecnologia de sansure.
O isolamento e a purificação automatizados do RNA viral SARS-CoV-2 seguem o princípio do cordão magnético usando reagentes de preparação de amostra de DNA Abbott. A inativação de amostras e a solubilização de partículas virais é realizada usando um detergente contendo isotiocianato de guanidina para desnaturar a proteína e inativar a RNase. O RNA é então separado da proteína por separação de fase sólida usando sílica, ou seja, o sal de guanidínio e o pH alcalino do tampão de lise promovem a ligação dos ácidos nucleicos à sílica (SiO2). A etapa de enxágue remove as proteínas e detritos restantes para produzir uma solução clara. O RNA transparente é isolado de micropartículas baseadas em sílica usando o campo magnético do instrumento20,21. Por outro lado, o isolamento manual e a purificação do RNA é realizado pelo método da coluna de rotação usando centrifugação em vez de um suporte magnético e separação de micropartículas do eluente.
O teste de detecção SARS-CoV-2 em tempo real do Abbott (Abbott Molecular, Inc.) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, que receberam a EUA19,22 da OMS e FDA. Neste protocolo, a inativação da amostra antes da extração foi realizada em banho -maria a 56 ° C por 30 min. Após a inativação do vírus, a extração do ácido nucleico foi realizada em um instrumento Abbott M2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM usando um sistema de preparação de amostra de DNA do Abbott M2000. De acordo com o fabricante. A amplificação e a detecção foram realizadas usando um instrumento Abbott M2000 RT-PCR, e a detecção dupla foi realizada para os genes RDRP e N. Rox) e Vic P (corante proprietário) para direcionamento e detecção de controles internos, permitindo a detecção simultânea de ambos os produtos de amplificação 19.
O método de detecção de amplificação deste kit é baseado na tecnologia RT-PCR de uma etapa. Os genes orf1a/b e n foram selecionados como regiões conservadas pela tecnologia do gene Daan para detectar a amplificação da região alvo. Primers específicos e sondas fluorescentes (sondas de genes N marcadas com sondas FAM, ORF1A/B marcadas com VIC) foram projetadas para detectar o RNA SARS-CoV-2 em amostras. As misturas finais e eluentes e mestre foram preparadas adicionando 5 µl de eluente a 20 µl da mistura mestre a um volume final de 25 µL. A amplificação e detecção foram realizadas simultaneamente em um instrumento de PCR em tempo real ABI 750024.
Os genes ORF1A/B e N foram detectados usando o kit de diagnóstico de ácido nucleico Sansure Biotech NCOV-2019 (Detecção de PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada gene alvo selecionando o canal FAM para a região ORF1A/B e o canal ROX para o gene n. Para este kit de ensaio, os reagentes de eluente e mestre da mistura são adicionados da seguinte forma: Prepare 30 µl de reagente de mistura mestre e 20 µl de amostra eluída para detecção/amplificação. O PCR em tempo real ABI 750025 foi usado para amplificação/detecção.
O teste BGI SARS-COV-2 é um kit RRT-PCR em tempo real fluorescente para o diagnóstico de Covid-19. A região alvo está localizada na região ORF1A/B do genoma SARS-CoV-2, que é um método de detecção de genes único. Além disso, o gene de limpeza humana β-actina é um gene alvo regulado internamente. A mistura mestre é preparada misturando 20 µl do reagente da mistura mestre e 10 µl da amostra de RNA extraída em uma placa de poço26. Um instrumento de PCR quantitativo em tempo real ABI 7500 foi usado para amplificação e detecção. Todas as amplificações de ácido nucleico, condições de execução de PCR para cada ensaio e interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com as respectivas instruções do fabricante (Tabela 3).
Nesta análise comparativa, não usamos o método padrão de referência para determinar a porcentagem de concordância (positiva, negativa e geral) e outros parâmetros de comparação para as quatro análises. Cada comparação de teste foi feita com o CRS; neste estudo, o CRS foi definido pela regra "qualquer positivo" e o resultado foi determinado, não por um único teste, usamos pelo menos dois resultados de testes correspondentes. Além disso, no caso da transmissão COVID-19, os resultados falsos negativos são mais perigosos que os resultados positivos falsos. Portanto, para dizer "positivo" com a maior precisão possível de um resultado do CRS, pelo menos dois testes de ensaio devem ser positivos, o que significa que pelo menos um resultado positivo provavelmente virá de um ensaio da EUA. Assim, dos quatro resultados dos testes, dois ou mais resultados de teste que fornecem o mesmo resultado são considerados verdadeiros positivos ou negativos 18,27.
Os dados foram coletados usando formulários de extração de dados estruturados, entrada e análise de dados foram realizadas usando o software estatístico Excel e o SPSS versão 23.0 para estatística descritiva. A concordância percentual positiva, negativa e geral foi analisada e uma pontuação do KAPPA foi usada para determinar o grau de concordância de cada método com o CRS. Os valores de Kappa são interpretados da seguinte forma: 0,01 a 0,20 para concordância leve, 0,21 a 0,40 para concordância geral, 0,41-0,60 para concordância moderada, 0,61-0,80 para concordância principal e 0,81-0,99 para concordância completa28.
A depuração ética foi obtida da Universidade de Adis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foram aprovados pelo Conselho de Revisão de Ética Científica do Instituto de Saúde Pública da Etiópia. O número de referência para a licença de ética EPHI é EPHI/IRB-279-2020. Todos os métodos foram aplicados de acordo com as recomendações e disposições das diretrizes abrangentes nacionais etíopes para o tratamento do Covid-19. Além disso, o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo antes da participação no estudo.
Todos os dados obtidos ou analisados ​​neste estudo estão incluídos neste artigo publicado. Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis no respectivo autor, mediante solicitação razoável.
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