Desempenho de quatro ensaios de amplificação de ácido nucleico para identificar SARS-CoV-2 na Etiópia

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Desde o surto da doença de coronavírus de 2019 (COVID-19), muitos testes comerciais de amplificação de ácido nucleico (NAATs) foram desenvolvidos em todo o mundo e se tornaram ensaios padrão.Embora vários testes tenham sido rapidamente desenvolvidos e aplicados a testes de diagnóstico laboratorial, o desempenho desses testes não foi avaliado em uma variedade de configurações.Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho dos ensaios Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI e Sansure Biotech usando o Composite Reference Standard (CRS).O estudo foi realizado no Instituto de Saúde Pública da Etiópia (EPHI) de 1 a 30 de dezembro de 2020. 164 amostras nasofaríngeas foram extraídas usando o mini kit QIAamp RNA e o sistema de preparação de amostras de DNA Abbott.De 164 espécimes, 59,1% foram positivos e 40,9% foram negativos para SRC. A positividade da Sansure Biotech foi significativamente baixa em comparação com CRS (p < 0,05). A positividade da Sansure Biotech foi significativamente baixa em comparação com CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Os resultados positivos da Sansure Biotech foram significativamente menores em comparação com o CRS (p < 0,05).与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比, Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech teve significativamente menos resultados positivos em comparação com CRS (p < 0,05).A concordância geral das quatro análises foi de 96,3 a 100% em comparação com o CRS.Além da baixa taxa de positividade do ensaio Sansure Biotech, o desempenho dos quatro ensaios foi quase comparável.Como tal, o ensaio Sansure Biotech [Research Only (RUO)] requer validação adicional para seu uso na Etiópia.Finalmente, pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar ensaios com alegações apropriadas do fabricante.
Os testes de laboratório fazem parte do Plano Estratégico da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a Preparação e Resposta à Doença de Coronavírus 2019 (COVID-19) (SPRP).A OMS alerta que os países precisam desenvolver capacidade laboratorial para melhorar a preparação, o gerenciamento adequado de casos, a vigilância e a resposta rápida aos desafios de saúde pública.Isso sugere que o papel do laboratório é fundamental para caracterizar a doença e a epidemiologia de agentes infecciosos emergentes e controlar sua disseminação.
O diagnóstico de COVID-19 requer informações epidemiológicas e médicas, sintomas/sinais pessoais e dados radiográficos e laboratoriais2.Desde que o surto de COVID-19 foi relatado em Wuhan, China, muitos testes comerciais de amplificação de ácido nucleico (NAATs) foram desenvolvidos em todo o mundo.A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (rRT-PCR) tem sido usada como método padrão e de rotina para o diagnóstico laboratorial da infecção por síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2)3.A detecção molecular de SARS-CoV-2 é tipicamente baseada nos genes N (gene da proteína do nucleocapsídeo), E (gene da proteína do envelope) e RdRp (gene da polimerase de RNA dependente de RNA) em ORF1a/b (quadro de leitura aberta 1a/b) .gene) região identificada a partir do genoma viral.São consideradas as principais regiões conservadas encontradas nos genomas virais para o reconhecimento viral4.Dentre esses genes, os genes RdRp e E possuem alta sensibilidade de detecção analítica, enquanto o gene N possui baixa sensibilidade analítica5.
O desempenho dos ensaios de PCR pode variar dependendo de vários fatores, como: reagentes de extração, reagentes de amplificação/detecção, método de extração, qualidade da máquina de PCR e outros instrumentos.Em abril de 2020, mais de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nove países receberam Autorização de Uso de Emergência (EUA) para diagnósticos de COVID-196.Na Etiópia, mais de 14 plataformas de PCR em tempo real são usadas para detecção por PCR de SARS-CoV-2 em 26 instituições de saúde pública, incluindo ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 e Quant-studio7.Além disso, vários kits de teste de PCR estão disponíveis, como o teste Daan Gene, o teste Abbott SARS-CoV-2, o teste Sansure Biotech e o teste SARS-CoV-2 BGI.Embora o rRT-PCR seja altamente sensível, alguns pacientes com COVID-19 relatam resultados falsos negativos devido a cópias insuficientes de ácido ribonucleico viral (RNA) em amostras devido à coleta, transporte, armazenamento e manuseio inadequados e testes laboratoriais.condições e ações do pessoal8.Além disso, o manuseio incorreto da amostra ou do controle, a configuração do limite do ciclo (Ct) e a reatividade cruzada com outros ácidos nucleicos patogênicos ou RNA SARS-CoV-2 inativo/residual podem levar a resultados falsos positivos nos ensaios rRT-PCR9.Assim, fica claro que os testes de PCR podem de fato identificar portadores de fragmentos gênicos, pois não conseguem sequer distinguir entre genes virais realmente ativos, de modo que os testes podem identificar apenas portadores e não pacientes10.Portanto, é importante avaliar o desempenho diagnóstico usando métodos padrão em nosso meio.Embora muitos reagentes NAAT estejam disponíveis no Instituto Etíope de Saúde Pública (EPHI) e em todo o país, nenhuma avaliação comparativa de sua eficácia foi relatada.Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho comparativo de kits disponíveis comercialmente para a detecção de SARS-CoV-2 por rRT-PCR usando espécimes clínicos.
Um total de 164 participantes com suspeita de COVID-19 foram incluídos neste estudo.A maioria das amostras era de centros de tratamento (118/164 = 72%), enquanto os 46 restantes (28%) participantes eram de centros sem tratamento.Entre os participantes não atendidos no centro, 15 (9,1%) tiveram casos suspeitos clinicamente e 31 (18,9%) tiveram contatos de casos confirmados.Noventa e três (56,7%) participantes eram do sexo masculino, e a idade média (± DP) dos participantes foi de 31,10 (± 11,82) anos.
Neste estudo, foram determinadas taxas positivas e negativas de quatro testes para COVID-19.Assim, as taxas positivas do ensaio Abbott SARS-CoV-2, ensaio Daan Gene 2019-nCoV, ensaio SARS-CoV-2 BGI e ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foram de 59,1%, 58,5%, 57,9% e 55,5%, respectivamente .Os escores positivos e negativos do padrão de referência composto (CRS) foram 97 (59,1%) e 67 (40,9%), respectivamente (Tabela 1).Neste estudo, a definição de SRC baseou-se na regra “qualquer positivo”, segundo a qual, de quatro resultados de testes, dois ou mais resultados de testes que deram o mesmo resultado foram considerados verdadeiros positivos ou negativos.
Neste estudo, encontramos uma concordância percentual negativa (NPA) de 100% (IC 95% 94,6–100) para todas as análises em comparação com o CRS.A análise da Sansure Biotechnology mostrou um PPA mínimo de 93,8% (95% CI 87,2-97,1) e a análise Daan Gene 2019-nCoV teve uma concordância geral de 99,4% (95% CI 96,6-99,9).Por outro lado, a concordância geral entre o ensaio SARS-CoV-2 BGI e o ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foi de 98,8% e 96,3%, respectivamente (Tabela 2).
O coeficiente de concordância kappa de Cohen entre os resultados do ensaio CRS e Abbott SARS-CoV-2 foi totalmente consistente (K = 1,00).Da mesma forma, os valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI e Sansure Biotech 2019-nCoV também são totalmente consistentes com CRS (K ≥ 0,925).Nesta análise comparativa, o teste do qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que os resultados do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV foram significativamente diferentes dos resultados do CRS (p = 0,031) (Tabela 2).
Como mostrado na Fig.1, a porcentagem do valor Ct mais baixo (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinado) foi de 87,6% e o valor Ct do gene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem de baixo O valor de Ct (< 20 Ct) foi de 50,3% e o valor alto de Ct (36–40 Ct) foi de 3,2%. 1, a porcentagem do valor Ct mais baixo (< 20 Ct) do ensaio Abbott SARS-CoV-2 (gene RdRp e N combinado) foi de 87,6% e o valor Ct do gene ORF1a/b do ensaio Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem de baixo O valor de Ct (< 20 Ct) foi de 50,3% e o valor alto de Ct (36–40 Ct) foi de 3,2%.Como mostrado na Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, a porcentagem do valor Ct mais baixo (< 20 Ct) da análise do Abbott SARS-CoV-2 (gene combinado RdRp e N) foi de 87,6%, e o valor Ct da análise do gene ORF1a/b do Sansure Biotech 2019-nCoV mostrou que a porcentagem de baixo valor de Ct (< 20 Ct) representou 50,3% e alto valor de Ct (36–40 Ct) representou 3,2%.如 图 1 所 ， ， Abbott Sars-Cov-2 检测 （rdrp 和 n 基因） 的 最 低 ct 值 （（<20 ct） 为 87,6%， sansure biotech 2019-NCov 检测 ouf1a/b 基因 值 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低值(< 20 Ct) 的百分比为50.3%，高Ct 值(36–40 Ct) 的百分比为3.2%。 Conforme mostrado na Figura 1, a menor porcentagem do valor Ct (< 20 Ct) do teste Abbott SARS-CoV-2 (combinação de RdRp e gene N) é de 87,6%, o valor Ct do gene ORF1a/b do teste Sansure Biotech 2019-nCoV mostra que a porcentagem baixa de Ct值(< 20 Ct) 的 é de 50,3%, a porcentagem de 高Ct值(36–40 Ct) 的 é de 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 - Анализ nCoV показал низкий Ct. Conforme mostrado na Figura 1, o ensaio Abbott SARS-CoV-2 (combinando os genes RdRp e N) teve o valor Ct percentual mais baixo (< 20 Ct) em 87,6%, enquanto o valor Ct do gene ORF1a/b no Sansure Estudo Biotech 2019 – A análise do nCoV mostrou um baixo Ct. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. A porcentagem de valores (< 20 Ct) foi de 50,3%, e a porcentagem de valores altos de Ct (36–40 Ct) foi de 3,2%.O teste Abbott SARS-CoV-2 B registrou valores de Ct acima de 30. Por outro lado, no ensaio BGI SARS-CoV-2, o gene ORF1a/b apresentou um alto valor de Ct (> 36 Ct), a porcentagem foi de 4% (Fig. 1). Por outro lado, no ensaio BGI SARS-CoV-2, o gene ORF1a/b apresentou um alto valor de Ct (> 36 Ct), a porcentagem foi de 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (рис. 4%). Por outro lado, na análise de BGI SARS-CoV-2 o gene ORF1a/b apresentou alto valor de Ct (> 36 Ct), cuja porcentagem foi de 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Por outro lado, na detecção de BGI SARS-CoV-2, a porcentagem do gene ORF1a/b com alto valor de Ct (>36 Ct) é de 4% (Figura 1). No caso do BGI SARS-CoV-2, o ORF1a/b é classificado como Ct (>36 Ct) 4% (Riso. 1). Por outro lado, na análise BGI SARS-CoV-2, a porcentagem de genes ORF1a/b com altos valores de Ct (>36 Ct) foi de 4% (Fig. 1).
Neste estudo, coletamos 164 amostras de nasofaringe.Para todos os tipos de ensaios, o isolamento e a amplificação do RNA foram realizados usando os métodos e kits recomendados pelos respectivos fabricantes.
Este estudo demonstrou que o teste de Abbott para SARS-CoV-2 tem o mesmo desempenho de detecção que o CRS, com 100% de concordância positiva, negativa e geral.A concordância kappa de Cohen é de 1,00, indicando total concordância com a CRS.Um estudo semelhante da Universidade de Washington, nos EUA, descobriu que a sensibilidade e a especificidade gerais do teste Abbott para SARS-CoV-2 eram de 93% e 100%, respectivamente, em comparação com o ensaio determinado por laboratório (LDA) do CDC .11. O sistema de detecção Abbott SARS-CoV-2 é baseado na detecção combinada simultânea dos genes N e RdRp, pois ambos os genes são mais sensíveis, minimizando falsos negativos12.Um estudo em Viena, Áustria, também mostrou que grandes volumes de amostra de extração e volumes de eluente de detecção minimizaram os efeitos da diluição e aumentaram a eficiência da detecção13.Assim, a combinação perfeita de Abbott para o ensaio SARS-CoV-2 pode ser associada a um sistema de detecção de plataforma que detecta simultaneamente genes combinatórios, extrai um grande número de amostras (0,5 ml) e usa uma grande quantidade de eluente (40 µl).
Nossos resultados também mostraram que o desempenho de detecção do teste genético Daan foi quase o mesmo que o do CRS.Isso é consistente com um estudo14 realizado na Universidade de Anhui em Huainan, China, e a afirmação do fabricante de 100% de concordância positiva.Apesar dos relatos de resultados consistentes, uma amostra foi falso negativa após testar novamente o mesmo eluato, mas foi positiva nos ensaios Abbott SARS-CoV-2 e Sansure Biotech nCoV-2019.Isso sugere que pode haver variabilidade nos resultados em diferentes tipos de ensaios. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação com o ensaio de referência definido em laboratório. No entanto, no estudo realizado na China15, o resultado do ensaio Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação com o ensaio de referência definido em laboratório. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. No entanto, em um estudo na China15, o resultado da análise de Daan Gene foi significativamente diferente (p < 0,05) de sua análise de referência laboratorial.然而, 在中国进行的研究中15, 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 5 异然而, 在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. No entanto, em um estudo na China15, os resultados do teste genético de Daan foram significativamente diferentes (p < 0,05) em relação ao seu teste de laboratório de referência.Essa discrepância pode ser devida à sensibilidade do teste de referência para detectar SARS-CoV-2, e mais estudos podem ser importantes para determinar a causa.
Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho comparativo do ensaio SARS-CoV-2 BGI com CRS, mostrando excelente concordância percentual positiva (PPA = 97,9%), concordância percentual negativa (NPA = 100%) e concordância percentual geral por gênero ( OP).).= 98,8%).Os valores de Kappa de Cohen mostraram boa concordância (K = 0,975).Estudos na Holanda16 e na China15 mostraram resultados consistentes.O teste SARS-CoV-2 BGI é um teste de detecção de gene único (ORF1a/b) usando 10 µl de eluato de amplificação/detecção.Apesar da boa concordância estatística com nossos resultados de referência, a análise perdeu duas amostras positivas (1,22%) da amostra total.Isso pode ter enormes implicações clínicas para a dinâmica de transmissão tanto no nível do paciente quanto da comunidade.
Outra análise comparativa incluída neste estudo foi o ensaio Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO);a porcentagem geral de correspondência foi de 96,3%.A força de concordância também foi determinada pelo valor do Kappa de Cohen, que foi de 0,925, indicando total concordância com o CRS.Novamente, nossos resultados são idênticos aos estudos conduzidos na Central South University em Changsha, China, e no Departamento de Laboratório Clínico do Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, China17. Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste do qui-quadrado (teste MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação com o CRS (p < 0,005). Embora a boa concordância estatística acima tenha sido registrada, o teste do qui-quadrado (teste MacNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech teve uma diferença estatisticamente significativa em comparação com o CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Embora tenha sido registrada a boa concordância estatística acima, o teste qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou que o resultado do ensaio Sansure Biotech apresentou diferença estatisticamente significativa em relação ao CRS (p < 0,005).尽管 记录 上述 良好 的 统计 ， ， 但 检验 （MacNemar 检验） 表明 ， Sansure Biotech 检测 的 与 Crs 相比 具有 统计学 显着 差异 （（p <0,005）。尽管 记录 上述 良好 统计 一致 性 ， 但 （（MacNemar 检验 ， ， Sansure Biotech 检测 与 Crs 相比 显着 显着 （（P <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Apesar da boa concordância estatística observada acima, o teste qui-quadrado (teste de McNemar) mostrou uma diferença estatisticamente significativa (p < 0,005) entre o ensaio Sansure Biotech e o CRS.Seis amostras (3,66%) foram falsas negativas em relação ao CRS (Tabela Complementar 1);isso é muito importante, principalmente pela dinâmica de transmissão do vírus.Os dados acima também suportam essa baixa taxa de detecção15.
Neste estudo, os valores de Ct foram determinados para cada ensaio e respectiva plataforma, com o menor valor médio de Ct relatado no ensaio Abbott SARS-CoV-2.Esse resultado pode estar relacionado ao sistema de testes genéticos combinados simultâneos da Abbott para a detecção de SARS-CoV-2.Portanto, de acordo com a Figura 1, 87,6% dos resultados do Abbott SARS-CoV-2 apresentaram valores de Ct abaixo de 20. Apenas um pequeno número de resultados da amostra (12,4%) estava na faixa de 20-30.Valores de Ct acima de 30 não foram registrados.Além do uso do formato de teste genético do painel SARS-CoV-2 pela Abbott, esse resultado pode estar relacionado ao limite inferior de detecção (32,5 cópias de RNA/mL)18, que é três vezes menor do que o limite inferior da empresa de 100 cópias de RNA /mL.ml)19.
Este estudo tem algumas limitações: em primeiro lugar, não temos métodos padrão/referência [como carga viral ou outros testes laboratoriais (LDA)] devido à falta de recursos.Segundo, todos os espécimes usados ​​neste estudo eram swabs nasofaríngeos, enquanto os resultados não eram aplicáveis ​​a outros tipos de espécimes e, terceiro, o tamanho de nossa amostra era pequeno.
Este estudo comparou o desempenho de quatro ensaios rRT-PCR para SARS-CoV-2 usando amostras nasofaríngeas.Todos os ensaios de detecção tiveram desempenho quase comparável, com exceção do ensaio Sansure Biotech. Além disso, foi identificada baixa taxa de positividade no ensaio Sansure Biotech em comparação com o CRS (p < 0,05). Além disso, foi identificada baixa taxa de positividade no ensaio Sansure Biotech em comparação com o CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Além disso, o teste Sansure Biotech apresentou baixo percentual de resultados positivos em relação ao CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Além disso, o ensaio Sansure Biotech teve uma taxa de positividade menor em comparação com o CRS (p < 0,05).A análise Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA e concordância geral excedeu 93,5% com uma força Cohen Kappa de valor de concordância de 0,925.Finalmente, o Sansure Biotech Assay (RUO) precisa de mais validação para uso na Etiópia, e pesquisas adicionais devem ser consideradas para avaliar as alegações de fabricantes individuais.
O desenho do estudo comparativo foi realizado em quatro unidades de saúde em Adis Abeba, Hospital Eka Kotebe, Centro de Tratamento da Igreja Millennium, Hospital Zewooditu Memorial e Hospital Especializado em Tuberculose de St. Peter.Os dados foram coletados entre 1º e 31 de dezembro de 2020. As unidades médicas para este estudo foram escolhidas propositalmente com base no alto número de casos e na disponibilidade dos principais centros de tratamento da cidade.Da mesma forma, os instrumentos, incluindo os instrumentos de PCR em tempo real ABI 7500 e Abbott m2000, foram selecionados de acordo com as recomendações dos fabricantes de reagentes NAAT, e quatro kits de detecção de PCR foram selecionados para este estudo, já que a maioria dos laboratórios na Etiópia usava pelo menos quatro deles.Teste genético, teste Abbott SARS-CoV-2, teste Sansure Biotech e teste SARS-CoV-2 BGI realizados durante o estudo).
O teste para SARS-CoV-2 foi realizado de 1 a 30 de dezembro de 2020 usando 3 ml de meio de transporte viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de indivíduos sob investigação para COVID-19 encaminhados para EPHI.Amostras de nasofaringe foram coletadas por coletores treinados e enviadas ao EPHI em embalagens triplas.Antes do isolamento do ácido nucleico, cada amostra recebe um número de identificação exclusivo.A extração é realizada de cada amostra imediatamente após a chegada, usando métodos de extração manual e automático.Assim, para a extração automática de Abbott m2000, 1,3 ml (incluindo 0,8 ml de volume morto e 0,5 ml de volume de entrada de extração) da amostra foi extraído de cada amostra e passado pelo Abbott DNA Sample Preparing System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA).) Um lote de 96 [92 amostras, dois controles de detecção e dois controles sem modelo (NTC)] foi incluído no processo geral (recuperação e detecção) de duas rodadas de SARS-CoV-2 (EUA) em tempo real.mineração.Da mesma forma, para extração manual, use as mesmas amostras (para extração e descoberta automáticas).Assim, ao longo do processo, amostras de 140 µl foram aliquotadas e extraídas usando o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) em lotes de 24 (incluindo 20 amostras, dois controles de ensaio e dois NTCs) em nove rodadas.Os eluatos extraídos manualmente foram amplificados e detectados usando um termociclador ABI 7500 usando o ensaio SARS-CoV-2 BGI, ensaio Daan Gene e ensaio Sansure Biotech.
O isolamento e a purificação automatizados do RNA viral do SARS-CoV-2 seguem o princípio da esfera magnética usando reagentes de preparação de amostras de DNA da Abbott.A inativação das amostras e a solubilização das partículas virais são realizadas com detergente contendo isotiocianato de guanidina para desnaturar a proteína e inativar a RNase.O RNA é então separado da proteína por separação de fase sólida usando sílica, ou seja, o sal de guanidínio e o pH alcalino do tampão de lise promovem a ligação dos ácidos nucléicos à sílica (SiO2).A etapa de enxágue remove as proteínas e detritos restantes para produzir uma solução límpida.O RNA transparente é isolado de micropartículas à base de sílica usando o campo magnético do instrumento20,21.Por outro lado, o isolamento e purificação manual do RNA é realizado pelo método da coluna de spin usando centrifugação em vez de um suporte magnético e separação de micropartículas do eluente.
O Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, que recebeu EUA19,22 da OMS e FDA.Neste protocolo, a inativação da amostra antes da extração foi realizada em banho-maria a 56 °C por 30 min.Após a inativação do vírus, a extração de ácido nucleico foi realizada em um instrumento Abbott m2000 SP de 0,5 ml de VTM usando um sistema de preparação de amostras de DNA Abbott m2000.de acordo com o fabricante.A amplificação e detecção foram realizadas usando um instrumento Abbott m2000 RT-PCR, e a detecção dupla foi realizada para os genes RdRp e N.ROX) e VIC P (corante proprietário) para direcionamento e detecção de controles internos, permitindo a detecção simultânea de ambos os produtos de amplificação 19 .
O método de detecção de amplificação deste kit é baseado na tecnologia RT-PCR de uma etapa.Os genes ORF1a/b e N foram selecionados como regiões conservadas pela Daan Gene Technology para detectar a amplificação da região alvo.Primers específicos e sondas fluorescentes (sondas de gene N marcadas com FAM, sondas ORF1a/b marcadas com VIC) foram projetadas para detectar RNA de SARS-CoV-2 em amostras.O eluente final e as misturas principais foram preparados adicionando 5 µl de eluente a 20 µl da mistura principal para um volume final de 25 µl.A amplificação e a detecção foram realizadas simultaneamente em um instrumento de PCR em tempo real ABI 750024.
Os genes ORF1a/b e N foram detectados usando o kit de diagnóstico de ácido nucléico Sansure Biotech nCoV-2019 (detecção de PCR fluorescente).Prepare sondas específicas para cada gene alvo selecionando o canal FAM para a região ORF1a/b e o canal ROX para o gene N.A este kit de ensaio, o eluente e os reagentes da mistura principal são adicionados da seguinte forma: prepare 30 µl de reagente da mistura principal e 20 µl de amostra eluída para detecção/amplificação.Real-time PCR ABI 750025 foi usado para amplificação/detecção.
O teste SARS-CoV-2 BGI é um kit rRT-PCR fluorescente em tempo real para o diagnóstico de COVID-19.A região alvo está localizada na região ORF1a/b do genoma SARS-CoV-2, que é um método de detecção de um único gene.Além disso, o gene de limpeza humano β-actina é um gene alvo regulado internamente.O master mix é preparado misturando 20 µl do reagente master mix e 10 µl da amostra de RNA extraída em uma placa de poço26.Um instrumento de PCR em tempo real quantitativo fluorescente ABI 7500 foi usado para amplificação e detecção.Todas as amplificações de ácidos nucleicos, condições de corrida de PCR para cada ensaio e interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com as instruções do respectivo fabricante (Tabela 3).
Nesta análise comparativa, não usamos o método padrão de referência para determinar a concordância percentual (positiva, negativa e geral) e outros parâmetros de comparação para as quatro análises.Cada comparação de teste foi feita com CRS, neste estudo o CRS foi definido pela regra “qualquer positivo” e o resultado foi determinado, não por um único teste, usamos pelo menos dois resultados de teste combinados.Além disso, no caso da transmissão do COVID-19, resultados falsos negativos são mais perigosos do que resultados falsos positivos.Portanto, para dizer “positivo” com a maior precisão possível de um resultado de CRS, pelo menos dois testes de ensaio devem ser positivos, o que significa que pelo menos um resultado positivo provavelmente virá de um ensaio de EUA.Assim, de quatro resultados de exames, dois ou mais resultados de exames que dão o mesmo resultado são considerados verdadeiros positivos ou negativos18,27.
Os dados foram coletados por meio de formulários de extração de dados estruturados, entrada e análise de dados foram realizadas usando o software estatístico Excel e SPSS versão 23.0 para estatística descritiva.A concordância percentual positiva, negativa e geral foi analisada, e um escore Kappa foi usado para determinar o grau de concordância de cada método com a CRS.Os valores de Kappa são interpretados da seguinte forma: 0,01 a 0,20 para concordância leve, 0,21 a 0,40 para concordância geral, 0,41 a 0,60 para concordância moderada, 0,61 a 0,80 para concordância maior e 0,81 a 0,99 para concordância completa28.
A liberação ética foi obtida da Universidade de Addis Abeba e todos os protocolos experimentais para este estudo foram aprovados pelo Conselho de Revisão de Ética Científica do Instituto de Saúde Pública da Etiópia.O número de referência para a Licença Ética EPHI é EPHI/IRB-279-2020.Todos os métodos foram aplicados de acordo com as recomendações e disposições das Diretrizes Nacionais Abrangentes da Etiópia para o Tratamento da COVID-19.Além disso, o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo antes da participação no estudo.
Todos os dados obtidos ou analisados ​​neste estudo estão incluídos neste artigo publicado.Os dados que suportam os resultados deste estudo estão disponíveis com o respectivo autor mediante solicitação razoável.
Organização Mundial da Saúde.Recomendações para estratégias de testes laboratoriais para COVID-19: Orientação provisória, 21 de março de 2020 Nº WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
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