Fatores de interferência em reações de PCR

Durante a reação de PCR, alguns fatores interferentes são frequentemente encontrados.
Devido à sensibilidade muito alta da PCR, a contaminação é considerada um dos fatores mais importantes que afetam os resultados da PCR e pode produzir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas são as várias fontes que levam a resultados falso-negativos.Se uma ou mais partes essenciais da mistura de PCR ou a própria reação de amplificação forem inibidas ou interferidas, o ensaio de diagnóstico pode ser prejudicado.Isso pode levar a uma eficiência reduzida e até a resultados falsos negativos.
Além da inibição, pode ocorrer perda da integridade do ácido nucleico alvo devido às condições de transporte e/ou armazenamento antes da preparação da amostra.Em particular, altas temperaturas ou armazenamento inadequado podem levar a danos nas células e nos ácidos nucléicos.A fixação de células e tecidos e a inclusão em parafina são causas bem conhecidas de fragmentação do DNA e um problema persistente (consulte as Figuras 1 e 2).Nesses casos, mesmo o isolamento e a purificação ideais não ajudarão.

Figura 1 |Efeito da imobilização na integridade do DNA
A eletroforese em gel de agarose mostrou que a qualidade do DNA isolado das seções de parafina das autópsias variou consideravelmente.DNA de diferentes comprimentos médios de fragmentos estava presente nos extratos, dependendo do método de fixação.O DNA foi preservado apenas quando fixado em amostras nativas congeladas e em formalina neutra tamponada.O uso de um fixador de Bouin fortemente ácido ou formalina contendo ácido fórmico não tamponado resultou em uma perda significativa de DNA.A fração restante é altamente fragmentada.
À esquerda, o comprimento dos fragmentos é expresso em pares de quilobases (kbp)

Figura 2 |Perda de integridade dos alvos de ácidos nucleicos
(a) Uma lacuna 3'-5' em ambas as fitas resultará em uma quebra no DNA alvo.a síntese de DNA ainda ocorrerá no pequeno fragmento.No entanto, se faltar um local de recozimento do iniciador no fragmento de DNA, ocorre apenas a amplificação linear.No caso mais favorável, os fragmentos podem ressaturar uns aos outros, mas os rendimentos serão pequenos e abaixo dos níveis de detecção.
(b) A perda de bases, principalmente devido à depurinação e à formação do dímero de timidina, leva a uma diminuição no número de ligações H e uma diminuição na Tm.Durante a fase de aquecimento alongado, os primers irão se desprender do DNA da matriz e não irão se recozir mesmo sob condições menos rigorosas.
(c) Bases de timina adjacentes formam um dímero TT.
Outro problema comum que ocorre frequentemente em diagnósticos moleculares é a liberação abaixo do ideal de ácidos nucleicos alvo em comparação com a extração de fenol-clorofórmio.Em casos extremos, isso pode estar associado a falsos negativos.Muito tempo pode ser economizado por lise fervente ou digestão enzimática de detritos celulares, mas esse método geralmente resulta em baixa sensibilidade de PCR devido à liberação insuficiente de ácido nucleico.

Inibição da atividade da polimerase durante a amplificação

Em geral, a inibição é usada como um conceito de contêiner para descrever todos os fatores que levam a resultados de PCR abaixo do ideal.No sentido estritamente bioquímico, a inibição limita-se à atividade da enzima, ou seja, reduz ou impede a conversão substrato-produto por meio da interação com o sítio ativo da DNA polimerase ou seu cofator (por exemplo, Mg2+ para Taq DNA polimerase).
Os componentes da amostra ou vários tampões e extratos contendo reagentes podem inibir diretamente a enzima ou capturar seus cofatores (por exemplo, EDTA), inativando assim a polimerase e, por sua vez, levando a resultados de PCR negativos falsos ou diminuídos.
No entanto, muitas interações entre os componentes da reação e os ácidos nucleicos contendo o alvo também são designadas como 'inibidores de PCR'.Uma vez que a integridade da célula é rompida pelo isolamento e o ácido nucléico é liberado, podem ocorrer interações entre a amostra e sua solução circundante e a fase sólida.Por exemplo, 'scavengers' podem se ligar ao DNA de fita simples ou dupla por meio de interações não covalentes e interferir no isolamento e purificação, reduzindo o número de alvos que eventualmente atingem o recipiente de reação de PCR.
Em geral, os inibidores de PCR estão presentes na maioria dos fluidos corporais e reagentes usados ​​para testes de diagnóstico clínico (uréia na urina, hemoglobina e heparina no sangue), suplementos dietéticos (componentes orgânicos, glicogênio, gordura, íons Ca2+) e componentes ambientais (fenóis , metais pesados)

Os inibidores de PCR mais prevalentes podem ser encontrados em bactérias e células eucarióticas, DNA não-alvo, macromoléculas de ligação ao DNA de matrizes de tecidos e equipamentos de laboratório, como luvas e plásticos.A purificação de ácidos nucleicos durante ou após a extração é o método preferido para a remoção de inibidores de PCR.
Hoje, vários equipamentos de extração automatizados podem substituir muitos protocolos manuais, mas 100% de recuperação e/ou purificação dos alvos nunca foi alcançado.Inibidores potenciais ainda podem estar presentes nos ácidos nucleicos purificados ou podem já ter feito efeito.Existem diferentes estratégias para reduzir o impacto dos inibidores.A escolha da polimerase apropriada pode ter um impacto significativo na atividade do inibidor.Outros métodos comprovados para reduzir a inibição da PCR são aumentar a concentração de polimerase ou aplicar aditivos como BSA.
A inibição das reações de PCR pode ser demonstrada pelo uso do controle interno de qualidade do processo (IPC).
Deve-se tomar cuidado para remover todos os reagentes e outras soluções no kit de extração, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol e fenol, do isolado de ácido nucleico por meio de uma etapa de lavagem completa.Dependendo de sua concentração, eles podem ativar ou inibir a PCR.