Fatores de interferência em reações de PCR

Durante a reação de PCR, alguns fatores interferentes são frequentemente encontrados.
Devido à sensibilidade muito elevada da PCR, a contaminação é considerada um dos factores mais importantes que afectam os resultados da PCR e pode produzir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas são as diversas fontes que levam a resultados falso-negativos. Se uma ou mais partes essenciais da mistura de PCR ou a própria reacção de amplificação forem inibidas ou interferidas, o ensaio de diagnóstico pode ser prejudicado. Isso pode levar à redução da eficiência e até mesmo a resultados falsos negativos.
Além da inibição, pode ocorrer perda da integridade do ácido nucleico alvo devido às condições de envio e/ou armazenamento antes da preparação da amostra. Em particular, altas temperaturas ou armazenamento inadequado podem causar danos às células e aos ácidos nucleicos. A fixação de células e tecidos e a inclusão em parafina são causas bem conhecidas de fragmentação do DNA e um problema persistente (ver Figuras 1 e 2). Nestes casos, mesmo o isolamento e a purificação ideais não ajudarão.

Figura 1 | Efeito da imobilização na integridade do DNA
A eletroforese em gel de agarose mostrou que a qualidade do DNA isolado das seções de parafina das autópsias variou consideravelmente. DNA de diferentes comprimentos médios de fragmentos estava presente nos extratos dependendo do método de fixação. O DNA foi preservado apenas quando fixado em amostras nativas congeladas e em formalina neutra tamponada. O uso de um fixador Bouin fortemente ácido ou formalina contendo ácido fórmico não tamponado resultou em uma perda significativa de DNA. A fração restante é altamente fragmentada.
À esquerda, o comprimento dos fragmentos é expresso em pares de quilobases (kbp)

Figura 2 | Perda de integridade dos alvos de ácidos nucleicos
(a) Uma lacuna de 3'-5' em ambas as fitas resultará em uma quebra no DNA alvo. a síntese de DNA ainda ocorrerá no pequeno fragmento. No entanto, se faltar um local de emparelhamento do iniciador no fragmento de ADN, ocorre apenas a amplificação linear. No caso mais favorável, os fragmentos podem resaturar-se mutuamente, mas os rendimentos serão pequenos e abaixo dos níveis de detecção.
(b) A perda de bases, principalmente devido à despurinação e à formação de dímeros de timidina, leva a uma diminuição no número de ligações H e a uma diminuição na Tm. Durante a fase de aquecimento prolongada, os iniciadores fundirão-se no ADN da matriz e não se emparelharão mesmo sob condições menos rigorosas.
(c) As bases de timina adjacentes formam um dímero TT.
Outro problema comum que ocorre frequentemente no diagnóstico molecular é a liberação abaixo do ideal de ácidos nucleicos alvo em comparação com a extração com fenol-clorofórmio. Em casos extremos, isso pode estar associado a falsos negativos. Muito tempo pode ser economizado por lise por ebulição ou digestão enzimática de restos celulares, mas este método muitas vezes resulta em baixa sensibilidade de PCR devido à liberação insuficiente de ácido nucleico.

Inibição da atividade da polimerase durante a amplificação

Em geral, a inibição é usada como um conceito recipiente para descrever todos os fatores que levam a resultados de PCR abaixo do ideal. Num sentido estritamente bioquímico, a inibição é limitada à atividade da enzima, ou seja, reduz ou impede a conversão substrato-produto através da interação com o sítio ativo da DNA polimerase ou seu cofator (por exemplo, Mg2+ para Taq DNA polimerase).
Os componentes da amostra ou vários tampões e extratos contendo reagentes podem inibir diretamente a enzima ou capturar seus cofatores (por exemplo, EDTA), inativando assim a polimerase e, por sua vez, levando a resultados de PCR diminuídos ou falsos negativos.
No entanto, muitas interacções entre os componentes da reacção e os ácidos nucleicos contendo o alvo são também designadas como “inibidores de PCR”. Uma vez que a integridade da célula é perturbada pelo isolamento e o ácido nucleico é libertado, podem ocorrer interacções entre a amostra e a solução circundante e a fase sólida. Por exemplo, os 'necrófagos' podem ligar DNA de cadeia simples ou dupla através de interações não covalentes e interferir no isolamento e purificação, reduzindo o número de alvos que eventualmente alcançam o recipiente de reação de PCR.
Em geral, os inibidores de PCR estão presentes na maioria dos fluidos corporais e reagentes utilizados para testes de diagnóstico clínico (uréia na urina, hemoglobina e heparina no sangue), suplementos dietéticos (componentes orgânicos, glicogênio, gordura, íons Ca2+) e componentes do meio ambiente (fenóis). , metais pesados)

Os inibidores de PCR mais prevalentes podem ser encontrados em bactérias e células eucarióticas, DNA não alvo, macromoléculas de matrizes de tecidos de ligação ao DNA e equipamentos de laboratório, como luvas e plásticos. A purificação de ácidos nucleicos durante ou após a extracção é o método preferido para remover inibidores de PCR.
Hoje, vários equipamentos de extração automatizados podem substituir muitos protocolos manuais, mas nunca foi alcançada 100% de recuperação e/ou purificação dos alvos. Os inibidores potenciais podem ainda estar presentes nos ácidos nucleicos purificados ou podem já ter entrado em vigor. Existem diferentes estratégias para reduzir o impacto dos inibidores. A escolha da polimerase apropriada pode ter um impacto significativo na atividade inibidora. Outros métodos comprovados para reduzir a inibição da PCR são aumentar a concentração de polimerase ou aplicar aditivos como BSA.
A inibição das reações de PCR pode ser demonstrada pelo uso do controle interno de qualidade do processo (IPC).
Deve-se ter cuidado para remover todos os reagentes e outras soluções do kit de extração, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol e fenol, do isolado de ácido nucleico por meio de uma etapa de lavagem completa. Dependendo da sua concentração, podem ativar ou inibir a PCR.