Fatores de interferência nas reações de PCR

Durante a reação de PCR, alguns fatores interferentes são frequentemente encontrados.
Devido à sensibilidade muito alta da PCR, a contaminação é considerada um dos fatores mais importantes que afetam os resultados da PCR e pode produzir resultados falsos positivos.
Igualmente críticos são as várias fontes que levam a resultados falsos negativos. Se uma ou mais partes essenciais da mistura de PCR ou a própria reação de amplificação forem inibidas ou interferidas, o ensaio diagnóstico poderá ser prejudicado. Isso pode levar a uma eficiência reduzida e até resultados falsos negativos.
Além da inibição, a perda da integridade do ácido nucleico alvo pode ocorrer devido às condições de remessa e/ou armazenamento antes da preparação da amostra. Em particular, altas temperaturas ou armazenamento inadequado podem levar a danos às células e ácidos nucleicos. A fixação de células e tecidos e incorporação de parafina são causas bem conhecidas de fragmentação do DNA e um problema persistente (ver Figuras 1 e 2). Nesses casos, mesmo o isolamento e a purificação ideais não ajudarão.

Figura 1 | Efeito da imobilização na integridade do DNA
A eletroforese em gel de agarose mostrou que a qualidade do DNA isolada das seções de parafina das autópsias variava consideravelmente. O DNA de diferentes comprimentos médios de fragmento estava presente nos extratos, dependendo do método de fixação. O DNA foi preservado apenas quando fixado em amostras congeladas nativas e em formalina neutra tamponada. O uso de um fixador fortemente ácido de bouin ou não bosques de formalina contendo ácido fórmico resultou em uma perda significativa de DNA. A fração restante é altamente fragmentada.
À esquerda, o comprimento dos fragmentos é expresso em pares de kilobase (KBP)

Figura 2 | Perda de integridade de alvos de ácido nucleico
(a) Um intervalo 3'-5 'em ambos os fios resultará em uma quebra no DNA alvo. A síntese do DNA ainda ocorrerá no pequeno fragmento. No entanto, se um local de recozimento de primer estiver ausente no fragmento de DNA, apenas a amplificação linear ocorre. No caso mais favorável, os fragmentos podem se resatar, mas os rendimentos serão pequenos e abaixo dos níveis de detecção.
(b) A perda de bases, principalmente devido à depurinação e formação de dímero da timidina, leva a uma diminuição no número de ligações H e uma diminuição na MT. Durante a fase de aquecimento alongada, os iniciadores derreterão do DNA da matriz e não se reconstruirão nem sob condições menos rigorosas.
(c) As bases de timina adjacentes formam um dímero TT.
Outro problema comum que geralmente ocorre no diagnóstico molecular é a liberação menos do que o ideal dos ácidos nucleicos alvo em comparação com a extração de fenol-clorofórmio. Em casos extremos, isso pode ser associado a falsos negativos. Muito tempo pode ser salvo por ebulitar lise ou digestão enzimática de detritos celulares, mas esse método geralmente resulta em baixa sensibilidade à PCR devido à liberação insuficiente de ácido nucleico.

Inibição da atividade da polimerase durante a amplificação

Em geral, a inibição é usada como um conceito de contêiner para descrever todos os fatores que levam a resultados abaixo do ideal de PCR. Em um sentido estritamente bioquímico, a inibição é limitada à atividade da enzima, ou seja, reduz ou impede a conversão do produto do substrato através da interação com o local ativo da polimerase de DNA ou seu cofator (por exemplo, mg2+ para polimerase de TAQ).
Componentes na amostra ou vários tampões e extratos contendo reagentes podem inibir diretamente a enzima ou prender seus cofatores (por exemplo, EDTA), inativando assim a polimerase e, por sua vez, levando a resultados de PCR diminuídos ou falsos negativos.
No entanto, muitas interações entre os componentes da reação e os ácidos nucleicos contendo alvo também são designados como 'inibidores de PCR'. Uma vez que a integridade da célula é interrompida pelo isolamento e o ácido nucleico é liberado, podem ocorrer interações entre a amostra e sua solução circundante e a fase sólida. Por exemplo, os 'catadores' podem ligar o DNA de fita única ou dupla através de interações não covalentes e interferir no isolamento e purificação, reduzindo o número de alvos que acabam atingindo o vaso de reação de PCR.
Em geral, os inibidores de PCR estão presentes na maioria dos fluidos e reagentes corporais usados ​​para testes de diagnóstico clínico (uréia em urina, hemoglobina e heparina no sangue), suplementos dietéticos (componentes orgânicos, glicogênio, gordura, ca2+ íons) e componentes no ambiente (fenóis, metais pesados)

Inibidores de PCR mais prevalentes podem ser encontrados em bactérias e células eucarióticas, DNA não alvo, macromoléculas de ligação ao DNA de matrizes de tecido e equipamentos de laboratório, como luvas e plásticos. A purificação de ácidos nucleicos durante ou após a extração é o método preferido para remover os inibidores da PCR.
Hoje, vários equipamentos de extração automatizados podem substituir muitos protocolos manuais, mas 100% de recuperação e/ou purificação de metas nunca foram alcançados. Inibidores em potencial ainda podem estar presentes nos ácidos nucléicos purificados ou podem já ter entrado em vigor. Existem estratégias diferentes para reduzir o impacto dos inibidores. A escolha da polimerase apropriada pode ter um impacto significativo na atividade do inibidor. Outros métodos comprovados para reduzir a inibição da PCR estão aumentando a concentração da polimerase ou aplicando aditivos como a BSA.
A inibição das reações de PCR pode ser demonstrada pelo uso do controle interno da qualidade do processo (IPC).
Deve -se tomar cuidado para remover todos os reagentes e outras soluções no kit de extração, como etanol, EDTA, Cetab, LiCl, Guscn, SDS, isopropanol e fenol, do isolado de ácido nucleico por um passo de lavagem aprofundada. Dependendo da concentração, eles podem ativar ou inibir a PCR.