Teste de metilação de DNA combinado com smartphones para triagem precoce de tumores e leucemia com precisão de 90,0%!

A detecção precoce do câncer por biópsia líquida é uma nova direção na detecção e diagnóstico do câncer proposta pelo Instituto Nacional do Câncer dos EUA nos últimos anos, com o objetivo de detectar o câncer precocemente ou mesmo lesões pré-cancerosas. Ela tem sido amplamente utilizada como um novo biomarcador para o diagnóstico precoce de diversas doenças malignas, incluindo câncer de pulmão, tumores gastrointestinais, gliomas e tumores ginecológicos.

O surgimento de plataformas para identificar biomarcadores de paisagem de metilação (Methylscape) tem o potencial de melhorar significativamente a triagem precoce do câncer, colocando os pacientes no estágio tratável mais precoce.

Recentemente, pesquisadores desenvolveram uma plataforma de sensoriamento simples e direta para detecção de paisagens de metilação baseada em nanopartículas de ouro decoradas com cisteamina (Cist/AuNPs), combinadas com um biossensor para smartphone, que permite o rastreamento precoce e rápido de uma ampla gama de tumores. O rastreamento precoce para leucemia pode ser realizado em até 15 minutos após a extração de DNA de uma amostra de sangue, com precisão de 90,0%. O título do artigo é "Detecção rápida de DNA cancerígeno em sangue humano usando AuNPs encapsuladas em cisteamina e um smartphone com aprendizado de máquina".

Figura 1. Uma plataforma de detecção simples e rápida para triagem de câncer por meio de componentes Cyst/AuNPs pode ser realizada em duas etapas simples.

Isso é mostrado na Figura 1. Primeiramente, uma solução aquosa foi usada para dissolver os fragmentos de DNA. Cistos/AuNPs foram então adicionados à solução misturada. DNA normal e maligno têm propriedades de metilação diferentes, resultando em fragmentos de DNA com diferentes padrões de automontagem. O DNA normal agrega-se frouxamente e, eventualmente, agrega Cistos/AuNPs, o que resulta na natureza desviada para o vermelho dos Cistos/AuNPs, de modo que uma mudança na cor de vermelho para roxo pode ser observada a olho nu. Em contraste, o perfil de metilação único do DNA canceroso leva à produção de aglomerados maiores de fragmentos de DNA.

Imagens de placas de 96 poços foram obtidas com a câmera de um smartphone. O DNA do câncer foi medido por um smartphone equipado com aprendizado de máquina, em comparação com métodos baseados em espectroscopia.

Rastreamento de câncer em amostras de sangue reais

Para ampliar a utilidade da plataforma de detecção, os pesquisadores aplicaram um sensor que distinguiu com sucesso entre DNA normal e cancerígeno em amostras de sangue reais. Os padrões de metilação em sítios CpG regulam epigeneticamente a expressão gênica. Em quase todos os tipos de câncer, observou-se que alterações na metilação do DNA e, portanto, na expressão de genes que promovem a tumorigênese se alternam.

Como modelo para outros cânceres associados à metilação do DNA, os pesquisadores utilizaram amostras de sangue de pacientes com leucemia e controles saudáveis ​​para investigar a eficácia do cenário de metilação na diferenciação de cânceres leucêmicos. Este biomarcador de cenário de metilação não só supera os métodos de triagem rápida de leucemia existentes, como também demonstra a viabilidade de sua extensão à detecção precoce de uma ampla gama de cânceres por meio deste ensaio simples e direto.

O DNA de amostras de sangue de 31 pacientes com leucemia e 12 indivíduos saudáveis ​​foi analisado. Conforme mostrado no gráfico de caixa na Figura 2a, a absorbância relativa das amostras de câncer (ΔA650/525) foi menor do que a do DNA de amostras normais. Isso se deveu principalmente à hidrofobicidade aumentada, levando à agregação densa do DNA do câncer, o que impediu a agregação de Cistos/AuNPs. Como resultado, essas nanopartículas foram completamente dispersas nas camadas externas dos agregados do câncer, o que resultou em uma dispersão diferente de Cistos/AuNPs adsorvidos em agregados de DNA normais e cancerígenos. Curvas ROC foram então geradas variando o limite de um valor mínimo de ΔA650/525 para um valor máximo.

Figura 2.(a) Valores de absorbância relativa de soluções de cisto/AuNPs mostrando a presença de DNA normal (azul) e cancerígeno (vermelho) em condições otimizadas

(DA650/525) de box plots; (b) Análise ROC e avaliação de testes diagnósticos. (c) Matriz de confusão para o diagnóstico de pacientes normais e com câncer. (d) Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN) e precisão do método desenvolvido.

Como mostrado na Figura 2b, a área sob a curva ROC (AUC = 0,9274) obtida para o sensor desenvolvido apresentou alta sensibilidade e especificidade. Como pode ser visto no gráfico de caixa, o ponto mais baixo representando o grupo de DNA normal não está bem separado do ponto mais alto representando o grupo de DNA cancerígeno; portanto, a regressão logística foi usada para diferenciar entre os grupos normal e cancerígeno. Dado um conjunto de variáveis ​​independentes, ela estima a probabilidade de ocorrência de um evento, como um grupo cancerígeno ou normal. A variável dependente varia entre 0 e 1. O resultado é, portanto, uma probabilidade. Determinamos a probabilidade de identificação de câncer (P) com base em ΔA650/525 da seguinte forma.

onde b = 5,3533, w1 = -6,965. Para a classificação da amostra, uma probabilidade menor que 0,5 indica uma amostra normal, enquanto uma probabilidade de 0,5 ou maior indica uma amostra com câncer. A Figura 2c ilustra a matriz de confusão gerada a partir da validação cruzada "deixar de lado", que foi usada para validar a estabilidade do método de classificação. A Figura 2d resume a avaliação do método em termos de teste diagnóstico, incluindo sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN).

Biossensores baseados em smartphones

Para simplificar ainda mais os testes de amostras sem o uso de espectrofotômetros, os pesquisadores usaram inteligência artificial (IA) para interpretar a cor da solução e distinguir entre indivíduos normais e cancerosos. Diante disso, a visão computacional foi usada para traduzir a cor da solução de cisto/AuNPs em DNA normal (roxo) ou DNA canceroso (vermelho) usando imagens de placas de 96 poços tiradas pela câmera de um celular. A inteligência artificial pode reduzir custos e melhorar a acessibilidade na interpretação da cor de soluções de nanopartículas, sem o uso de acessórios de hardware óptico para smartphones. Finalmente, dois modelos de aprendizado de máquina, incluindo Random Forest (RF) e Support Vector Machine (SVM), foram treinados para construir os modelos. Tanto o modelo RF quanto o SVM classificaram corretamente as amostras como positivas e negativas com uma precisão de 90,0%. Isso sugere que o uso de inteligência artificial em biossensores baseados em celulares é bem possível.

Figura 3.(a) Classe alvo da solução registrada durante a preparação da amostra para a etapa de aquisição de imagem. (b) Imagem de exemplo obtida durante a etapa de aquisição de imagem. (c) Intensidade de cor da solução de cisto/AuNPs em cada poço da placa de 96 poços extraída da imagem (b).

Utilizando Cyst/AuNPs, pesquisadores desenvolveram com sucesso uma plataforma de detecção simples para detecção de paisagens de metilação e um sensor capaz de distinguir DNA normal de DNA cancerígeno ao utilizar amostras de sangue reais para triagem de leucemia. O sensor desenvolvido demonstrou que o DNA extraído de amostras de sangue reais foi capaz de detectar de forma rápida e econômica pequenas quantidades de DNA cancerígeno (3 nM) em pacientes com leucemia em 15 minutos, apresentando uma precisão de 95,3%. Para simplificar ainda mais o teste de amostras, eliminando a necessidade de um espectrofotômetro, utilizou-se aprendizado de máquina para interpretar a cor da solução e diferenciar indivíduos normais de cancerígenos usando uma fotografia de celular, alcançando uma precisão de 90,0%.

Referência: DOI: 10.1039/d2ra05725e